Research progress on indanomycin natural products

在从土壤培养物中寻找新抗生素的过程中，Miller课题组从链霉菌Streptomyces sp. NRRL 8167的发酵液中分离得到了茚满霉素（1），为该家族第一例化合物。化合物1能够将1价和2价阳离子从水溶液中萃取到不相溶的有机溶剂中，另外，与一些只能运输特定单价阳离子（如K⁺或Na⁺）的离子载体抗生素不同，化合物1还能通过溶剂屏障（CHCl₃）将Rb⁺和Ca²⁺从一个水相转移到另一个水相，具有介导跨生物膜转运2价阳离子的特殊能力^[8]，迄今为止，仅有少数离子载体抗生素（如拉沙里菌素和离子霉素等）具有相似的运输能力^[1]。化合物1具有良好的抗菌、杀虫和抗原虫等活性^[9-10]，具有与其他离子载体抗生素类似的抗菌谱，在体外对G⁺菌Mycobacterium phlei、Streptomyces cellulosae、Staphylococcus aureus、Bacillus sp. E、Bacillus sp. TA、Sarcina lutea、Bacillus megate- rium、Bacillus subtilis的最低抑菌浓度（MIC）分别为3.1、0.8、0.2、0.2、0.2、0.1、0.1、0.1 μg/ml。研究显示，浓度为100 ppm的化合物1连续使用6 d可以使舞毒蛾和烟草天蛾幼虫的数量减少50%，使玉米穗虫的数量减少33%；浓度为20 ppm的化合物1可以使四龄的埃及伊蚊（Aedes aegypti）的死亡率达100%^[1]。王继栋等人发现，化合物1对人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和人肝腺癌细胞（HepG-2）具有一定程度的抑制作用，其IC₅₀值分别为14.01和7.26 μg/ml^[11]。

Kliuev等人从产生蒽环类抗生素galtamycin的链霉菌培养液中分离得到了一种新型类似物cafamycin（2）^[2]，其与化合物1的区别在于2位甲基被乙基取代，18位乙基被脱除。Occolowitz等人从美国蒙大拿州收集的土壤样品中分离出一种新的链霉菌Streptomyces setonii，并从中分离得到了一种新的类似物，即16-deethylindanomycin（3）^[3]，该化合物对Streptococcus pneumoniae Park I的MIC值为2 μg/ml，对Staphylococcus aureus X1.1、S. aureus V41、S. aureus V400、S. aureus S13E的MIC值为4 μg/ml。当化合物3的浓度为0.31μg/ml时，可以100%抑制柔嫩艾美耳球虫（Emeria tenella）的生长。Zhang等人从海洋链霉菌Streptomyces antibioticus PTZ0016中分离得到了化合物3的类似物，iso-16-deethylindanomycin（4）、16-deethylindanomycin 甲酯（5）和iso-16-deethylindanomycin 甲酯（6），这3种化合物在体外实验中都显示出对金黄色葡萄球菌的抑制活性，其MIC值为4.0~8.0 μg/ml^[4]。有趣的是，化合物4和6分别为化合物3和5的C-7手性异构体，这一现象在其他茚满霉素类似物中并不多见，提示该菌株中负责呋喃环形成的酶的立体选择性低。Homoindanomycin （7）分离自菌株Streptomyces galbus，其与化合物1唯一的区别在于2位上的甲基被乙基取代。Miao等人从链霉菌菌株Strepto-myces sp.的液体培养物中分离出一种新的天然产物stawamycin（8），化合物8保留了与化合物1类似的吡咯和四氢茚满结构，但不具有呋喃环，并且双键位置和构型与其他化合物相比也有明显区别，另外，该化合物的绝对构型并没有完全确定。化合物8具有抗人类疱疹病毒EB病毒（epstein-barr virus，EBV）活性，可以抑制病毒转录因子BZLF1与其DNA靶标的结合^[5]。Miho等人从绿色链霉菌Streptomyces viridochromogenes的菌丝体中分离得到了JBIR-11（9），是化合物8的衍生物，不同的是化合物9在末端羧基上结合了一分子色氨酸，而且化合物9具有抗肿瘤活性，对人纤维肉瘤HT1080细胞具有生长抑制作用，其IC₅₀值为25 μmol/L^[7]。茚满霉素及其天然类似物的结构式如图1所示。

由于茚满霉素中不同寻常的结构，如反式四氢茚满环和吡咯酮，其全合成被多次报道^[12-15]。Boeckman^[16]等人对茚满霉素进行了逆合成分析，选择利用串联Wittig反应与分子内Diels-Alder环加成反应来合成反式四氢茚满环骨架。吡喃醛中间体（10）和磷叶立德（11）发生wittig反应得到中间体（20），随后由分子内[4+2] Diels-Alder环加成反应得到化合物1。

化合物10的构建以活泼醛（12）为原料，在二烷基铜锂的作用下发生羟醛缩合反应得到醇类中间体（13），化合物13在过量臭氧下双键发生断裂后，被硫醚还原得到化合物14。在二叔丁基联苯锂的存在下，化合物14发生锂盐化，最后经PPTS催化得到化合物10（图2）。

化合物11的合成以二醇化合物（15）为起始原料，在DMAP催化作用下，伯羟基发生硅基烷基化反应，随后与二异丁基氢化铝在−78 ℃发生Claisen重排，得到烯醇（16）。化合物16进行磺基化反应后，以氰化钾作为氰源，合成氰化物（17）。化合物17在四丁基氟化铵和重金属氧化剂PDC作用下，得到α, β不饱和醛（18）。最后将化合物18与格氏试剂乙烯基溴化镁在−78 ℃进行无水无氧反应，由此得到的化合物19再与三苯基膦溴化氢反应，生成化合物11（图3）。

最后，化合物10和11在叔丁醇钾的作用下，发生wittig反应得到中间体20。化合物20被i-Bu₂AlH还原为醛，随后在1,2-二氯乙烷中与吡咯酮（21）反应，先后进行wittig反应与分子内Diels-Alder环加成反应，得到化合物22。化合物22在三甲基碘硅烷作用下脱保护，再与过量的三氧化铬发生氧化反应，得到目标化合物1（图4）。

该化合物的全合成历经21步，总体收率不高。反应过程需要使用锂化物、氢化铝、格氏试剂等危险品，还需要–78 ℃的低温无水反应，条件苛刻，并且使用到了剧毒化合物氰化钾、重金属试剂PDC及三氧化铬。因此，该方法对环境不友好，不符合绿色化学的理念，有待进一步的改善。

化合物1是杂合了非核糖体肽合成酶-聚酮合酶（NRPS-PKS）装配线的天然产物，Roege等人用¹³C标记的前体喂养实验确定了其代谢起源，包括1个L-脯氨酸、6个丙二酰辅酶A、2个甲基丙二酰辅酶A和2个乙基丙二酰辅酶A^[17-18]。Kelly课题组从抗生素链霉菌NRRL 8167中确认了化合物1的生物合成基因簇idm，其大小为80 kb左右（图5A）^[19]。其中16个基因参与了化合物1的生物合成（idm A-P），包括吡咯合成^[20]（pyrrole biosyn-thesis，idmI-K），调控和抗性基因（idmC，D，G），聚酮合成酶基因（idm L-P），聚酮前体合成基因（idmB，E，F），后修饰基因（idmA，H），另外7个基因经基因敲除实验验证与化合物1的合成无关（orf 1-4，orf 21-23）。起始单元吡咯-2-甲酰CoA是由L-脯氨酸经过脯氨酰依赖的转移酶（idmJ），载体蛋白（idmK）和黄素依赖的L-脯氨酰CoA脱氢酶（idmI）3个酶催化形成的（图5C）。IdmJ基因缺失实验证实idmJ参与了化合物1的生物合成。编码PKS的基因位于idmI-K的下游，包含编码idmL-P 5个酶，根据生物信息分析划分成10个模块：idmL（模块1~3），idmM（模块4和5），idmN（模块6~8），idmO（模块9），idmP（模块10和11）。PKS模块的结构域由酮基合成酶（KS）、酰基转移酶（AT）、脱氢酶（DH）、烯酰还原酶（ER）、酮基还原酶（KR）和酰基载体蛋白（ACP）等结构域组成，根据模块中的结构域分析，推测化合物1的PKS骨架形成与延伸过程如图5B所示。

模块1~10完成了化合物1的PKS骨架搭建，模块11是化合物1生物合成中的特殊PKS模块，它不参与聚酮链的延伸，而且它的模块结构不完整，仅包含一个KS单元、一个AT单元和一个特殊的cyc11单元，其中，cyc11单元与盐霉素（salinomycin）生物合成中的吡喃合成酶（SalBIII）的同源性较高，序列比对显示，cyc11（Asp28和Asp94）含有SalBIII（Asp38和Asp104）活性必需的残基^[21-22]，因此cyc11可能具有与盐霉素中吡喃形成类似的催化机制^[23]，即负责催化化合物23的C-3羟基脱水生成α, β-不饱和酮，然后进行C-7羟基的Michael加成产生化合物24。根据生物信息学预测，茚满霉素PKS模块最终对应的产物为含19-OH的中间体，而不是化合物23，因为其PKS模块2中无DH结构域，不能直接产生Δ19(20)双键。但是，该位置上双键需要作为化合物24上的亲双烯体进行[4+2]环加成以产生茚满环，具体哪个酶负责催化形成Δ19(20)双键目前尚不明确。另外，序列比对表明idmH与环化酶SnoaL^[24-25]存在很大的相似性，所以负责[4+2]环化形成茚满环结构的酶可能是idmH^{[19, 26]}，但目前尚无体外生化反应验证。根据生物信息学推测的茚满霉素后修饰合成路线如图5D所示。

含反式四氢茚满环结构的化合物在天然产物中比较少见，自1979年茚满霉素首次报道以来，这类化合物就引起了药物化学家和生物学家的广泛兴趣，本综述总结了其在生物活性、化学全合成以及生物合成等方面获得的研究成果，为该类天然产物的药用价值开发提供科学依据。虽然茚满霉素的生物合成步骤尚未完全阐明，但随着其生物合成基因簇的发现，利用组合生物合成的方法对该类化合物进行结构改造将成为可能。