-
成纤维细胞的增殖和活化引起的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的累积是肺纤维化的主要病理基础[1]。肺纤维化治疗难度大,且发展到晚期纤维化过程不可逆转,而一些药物的长期使用会提高肺纤维化的发生风险,对于这临床的一类并发症应格外重视。来氟米特(leflunomide,LEF)是治疗类风湿性关节炎的常用药物,但是有临床报道称,长期服用LEF可能提高肺纤维化的发生风险,但是也有研究认为LEF对肺纤维化影响不大[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)长度约为18~22个核苷酸,虽然不具备编码功能,但是可通过识别和碱基配对的方式与靶基因信使RNA(message RNA,mRNA)的3'非翻译区(3'UTR)结合,从而参与基因表达的调控[3]。miR-449a具有抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡的作用[4],并且最新研究发现miR-449a可能与肺纤维化有关,在二氧化硅诱导的肺纤维化模型中,miR-449a可通过调节自噬缓解纤维化[5]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是调节细胞增殖、凋亡和分化的重要蛋白,其磷酸化后可通过信号转导调控细胞生物学行为[6]。本文发现了miR-449a的过表达会显著缓解由LEF引起的肺成纤维细胞的增殖,而沉默miR-449a对细胞的影响相反,这可能是LEF引起肺纤维化的机制之一,报道如下。
HTML
-
使用qPCR检测各组细胞中miR-449a表达水平。结果显示mimic组miR-449a水平显著高于对照组,inhibitor组的miR-449a表达水平显著低于对照组(P<0.05),说明转染实验成功。LEF组的miR-449a水平显著低于对照组(P<0.05),并且LEF+mimic组的miR-449a的表达水平显著高于LEF组,LEF+inhibitor组的miR-449a显著低于LEF组(P<0.05)。表明LEF可抑制人成纤维细胞中miR-449a的表达,见表1。
组别 miR-449a 对照组 1.16±0.08 LEF组 0.58±0.05* LEF+mimic组 2.04±0.16# mimic组 6.32±0.63* LEF+inhibitor组 0.41±0.06# inhibitor组 0.77±0.07* *P<0.05,与对照组比较;#P<0.05,与LEF组比较 -
使用CCK-8法检测各组细胞的相对细胞活力。结果显示在第48小时和第72小时,LEF组和inhibitor组的细胞活力显著高于对照组(P<0.05),而mimic组的细胞活力显著低于对照组(P<0.05)。此外,LEF+mimic组的细胞活力显著低于LEF组,LEF+inhibitor组的细胞活力显著高于LEF组(P<0.05),过表达miR-449a可部分逆转LEF对促进人成纤维细胞的细胞活力的作用,而降低miR-449a的水平会进一步促进细胞活力,见表2。
组别 24 h 48 h 72 h 对照组 100.07±1.83 100.76±2.07 100.16±1.96 LEF组 103.67±2.06 110.83±2.15* 121.17±2.65* LEF+mimic组 99.98±2.14 98.57±2.11# 97.37±2.01# mimic组 97.54±1.97 91.79±2.35* 81.77±1.78* LEF+inhibitor组 107.68±2.08 118.67±3.07# 132.84±2.07# inhibitor组 104.31±1.79 111.38±2.67* 119.35±2.18* *P<0.05,与对照组比较;#P<0.05,与LEF组比较 -
LEF组和inhibitor组的克隆形成数目显著高于对照组而细胞凋亡率低于对照组(P<0.05),mimic组的克隆形成数目显著低于对照组而细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。此外,LEF+mimic组的克隆形成数目显著低于LEF组而细胞凋亡率显著高于LEF组(P<0.05),LEF+inhibitor组的克隆形成数目在LEF的基础上进一步升高而细胞凋亡率进一步降低(P<0.05)。过表达miR-449a可逆转LEF促进肺成纤维细胞增殖和抑制凋亡的作用,而低表达miR-449a会加剧LEF的作用,见表3。
组别 克隆形成数目(个) 细胞凋亡率(%) 对照组 54.32±4.36 5.53±0.94 LEF组 87.66±7.24* 3.11±0.76* LEF+mimic组 60.82±6.06# 6.73±1.26# mimic组 31.12±3.78* 17.32±3.28* LEF+inhibitor组 119.35±5.08# 2.14±0.62# inhibitor组 92.71±7.89* 3.45±0.83* *P<0.05,与对照组比较;#P<0.05,与LEF组比较 -
本次研究通过免疫荧光技术检测了各组α-SMA的水平来分析细胞向肌细胞转化情况,检测Col I的水平来分析ECM水平。其中蓝色荧光为细胞核,红色荧光为α-SMA或Col I蛋白。LEF组和inhibitor组的荧光强度显著高于对照组(P<0.05),而mimic组的相对荧光强度低于对照组(P<0.05)。此外,LEF+mimic组的相对荧光强度显著低于LEF组(P<0.05),LEF+inhibitor组的相对荧光强度显著高于LEF组(P<0.05)。过表达miR-449a可部分逆转LEF对促进人成纤维细胞α-SMA和Col I表达的促进作用,见图1、图2和表4。
组别 α-SMA Col I 对照组 1.02±0.11 1.24±0.14 LEF组 2.36±0.47* 2.57±0.38* LEF+mimic组 1.53±0.34# 1.89±0.25# mimic组 0.47±0.05* 0.45±0.06* LEF+inhibitor组 3.25±0.18# 4.13±0.54# inhibitor组 2.48±0.15* 3.11±0.39* *P<0.05,与对照组比较;#P<0.05,与LEF组比较 -
LEF组和inhibitor组的p-JNK/JNK水平高于对照组,mimic组的p-JNK/JNK水平显著低于对照组(P<0.05),并且LEF+mimic组中p-JNK/JNK水平显著低于LEF组(P<0.05),LEF+inhibitor组中p-JNK/JNK水平显著高于LEF组(P<0.05)。过表达miR-449a可逆转LEF促进JNK蛋白磷酸化的作用,见表5。
组别 p-JNK JNK p-JNK/JNK 对照组 2.04±0.18 2.16±0.16 0.94±0.09 LEF组 2.87±0.31 1.05±0.10 2.73±0.18* LEF+mimic组 1.67±0.19 2.24±0.21 0.75±0.07# mimic组 0.96±0.11 3.11±0.28 0.31±0.04* LEF+inhibitor组 3.04±0.24 1.10±0.10 2.76±0.25# inhibitor组 3.78±0.34 1.02±0.09 3.71±0.31* *P<0.05,与对照组比较;#P<0.05,与LEF组比较