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光热疗法(photothermal therapy,PTT)是近年来新兴的肿瘤治疗技术,相比传统的手术治疗、化疗和放疗,具有更小的副作用[1-4]。PTT包含2个要素,即近红外光和光敏剂。近红外光具有较强的组织穿透能力[5-6],照射后肿瘤组织中的光敏剂可将光能转换为热能,当温度达到42 ℃以上时,可导致肿瘤细胞的凋亡或坏死[7]。
硫化铜(CuS)纳米粒是一种优良的光敏剂。相比广泛研究的金纳米粒,CuS纳米粒具有制备成本低的优点,特别是其具有稳定的光热效应。CuS纳米粒的近红外吸收主要源于Cu2+的d-d能级跃迁,因而其光热效应不受粒径、形状和生理环境的影响,可在肿瘤组织中维持稳定的光热效应[8]。CuS纳米粒具有良好的生物相容性,细胞毒性较低,但与其他多数无机或金属纳米粒同样存在体内发生蓄积的风险,长期使用的安全性未知。肾脏是处理纳米粒的主要器官之一,报道显示,直径小于6 nm的纳米粒可被肾脏滤过,从而使大部分纳米粒经尿液排出体外[9-10]。
因此,本文拟制备粒径小于6 nm的CuS纳米粒,通过深入分析各因素,获得最优的处方工艺,进一步通过光热曲线和细胞实验进行体外评价。
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参考文献确定CuS纳米粒基本处方[11]:取100 μl CuCl2溶液(300 mmol/L)加入10 ml PVP溶液(100 mg/ml)中,再加入30 μl Na2S溶液(1 mol/L),室温磁力搅拌5 min后,转入90 ℃水浴继续磁力搅拌15 min,测定其粒径和多分散指数(polydispersity index,PDI)。
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考察搅拌时间、水浴温度、水浴时间、PVP浓度、CuCl2与Na2S摩尔比(Cu:S)对CuS纳米粒粒径和PDI的影响。
表1结果显示,搅拌时间越长,水浴温度越低,Cu:S越小,则CuS纳米粒粒径呈减小趋势。水浴时间越长,PVP浓度越大,粒径显示了先增大后减小的趋势。综合各因素不同水平对应的纳米粒粒径,发现水浴温度、PVP浓度和Cu:S易产生较大的粒径波动,表明其可能是影响CuS纳米粒粒径的主要因素。另外,各因素不同水平对PDI的影响均不显著。因此,根据单因素考察结果,确定搅拌时间为5 min,水浴时间为15 min,以粒径为评价指标,采用星点设计-响应面法进一步优化水浴温度、PVP浓度、Cu:S三个因素。
因子 水平 粒子大小 (nm) 多分散指数 搅拌时间 (min) 3 18.13±5.42 0.27±0.01 5 16.12±1.29 0.27±0.01 7 15.40±1.86 0.26±0.01 水浴温度 (℃) 80 14.61±4.35 0.27±0.01 90 16.12±1.29 0.27±0.01 100 22.85±1.71 0.26±0.01 水浴时间 (min) 10 18.12±6.31 0.25±0.02 15 16.12±1.29 0.27±0.01 20 21.30±5.71 0.24±0.01 PVP浓度 (mg/ml) 80 25.56±4.40 0.27±0.01 100 16.12±1.29 0.27±0.01 120 20.72±3.38 0.25±0.02 Cu:S 3:1 15.08±2.92 0.26±0.01 2:1 20.25±1.16 0.27±0.01 1:1 16.12±1.29 0.27±0.01 1:2 11.34±3.08 0.25±0.02 1:3 11.27±2.88 0.25±0.02 -
在单因素考察的基础上,采用中心复合响应面设计(central composite design, CCD),选择上述筛选出的三个因素:水浴温度(X1)、PVP浓度(X2)、Cu:S(X3)为考察因素,粒径(Y1)为评价指标,进行三因素五水平的星点设计。
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星点实验设计的因素、水平及代码值如表2所示,实验设计与结果如表3所示。
因子 水平 −1.682 −1 0 +1 +1.682 X1 (℃) 60.00 70 85 100 110.20 X2 (mg/ml) 66.36 80 100 120 133.64 X3 0.25 0.33 1.67 3 4 序号 X1 (℃) X2 (mg/ml) X3 Y1 (nm) 1 −1 −1 −1 13.04 2 +1 −1 −1 14.23 3 −1 +1 −1 14.48 4 +1 +1 −1 13.39 5 −1 −1 +1 24.37 6 +1 −1 +1 27.30 7 −1 +1 +1 18.62 8 +1 +1 +1 20.73 9 −1.682 0 0 18.87 10 +1.682 0 0 15.62 11 0 −1.682 0 24.01 12 0 +1.682 0 17.06 13 0 0 −1.682 13.92 14 0 0 +1.682 15.11 15 0 0 0 18.81 16 0 0 0 16.84 17 0 0 0 16.14 18 0 0 0 17.89 19 0 0 0 16.20 20 0 0 0 16.30 -
采用Design expert 8.0.6,将各影响因素(X1、X2、X3)和评价指标(Y1)进行二次多项式模型拟合,方程如下:
Y1=4.15−0.0086X1−0.18X2+0.42X3−0.045X1X2+0.064X1X3−0.17X2X3+0.043X12+0.17X22−0.22X32
此时二项式模型达显著水平(P=0.006 5),r=0.9129,说明该方程与实际情况拟合度良好。
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根据表3结果,绘制水浴温度(X1)、PVP浓度(X2)及Cu:S(X3)对粒径(Y1)的响应面。
根据图1的数据进行分析,确定最优参数为:水浴温度100 ℃,PVP浓度为100 mg/ml,Cu∶S为1∶3。按照最优处方工艺平行制备3份样品,粒径分别为9.37、12.39、9.84 nm,平均值为(10.53±1.63)nm,预测值为10.86 nm,根据公式:偏差=(预测值−实际值)/预测值×100%,得出实际值与预测值的偏差为3.04%,说明建立的数学模型较为可靠,预测性良好。
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取CuS纳米粒适量,加去离子水稀释10倍,取5 μl稀释后的CuS纳米粒,滴于缚有碳支持膜的铜网上,铜网下铺滤纸,用于吸去多余的液体。自然晾干后,用透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察纳米粒形态。图2结果显示,CuS纳米粒形态圆整,分散性良好,经Image J软件测量,平均粒径为(3.10±0.81)nm。
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将CuS纳米粒分别放置在4 ℃与25 ℃条件下,定时测定粒径。经统计发现,20 d内CuS纳米粒的粒径变化没有明显差异,说明所制的CuS纳米粒具有良好的粒径稳定性(图3)。
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⑴近红外光功率密度:考察CuS纳米粒浓度为50 μg /ml条件下,不同近红外光功率密度(0.5 、1、1.5、2 W/cm2)对CuS纳米粒光热效应的影响。采用980 nm的近红外激光器,红外热成像仪每隔30 s记录温度,记录10 min,平行测量3组,绘制升温曲线,同时,以水在相同条件下做对照。随着功率密度增大,CuS纳米粒升温加快(图4),而在相同条件下,去离子水的升温速率显著低于CuS纳米粒(图5)。
⑵CuS纳米粒浓度:考察在1 W/cm2功率密度下,CuS纳米粒不同浓度(25 、50 、150 、200 μg/ml)对其光热效应的影响,并以去离子水为空白对照。采用980 nm的近红外激光器,红外热成像仪每隔30 s记录温度,记录10 min,平行3组,绘制升温曲线。结果显示,在相同功率密度条件下,CuS纳米粒浓度越大,升温速率越大(图6)。
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采用980 nm近红外激光器,选取CuS浓度为50 μg /ml,激光功率密度为1 W/cm2,将激光器“开启-关闭”4个循环,即照射10 min后停止,温度恢复至室温后再次开启照射。如图7所示,CuS纳米粒经近红外光照射4个循环的温度变化曲线基本一致,即反复照射不影响CuS纳米粒的光热效应,表明其具有良好的光热稳定性。
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考察CuS纳米粒对正常人肾小管上皮细胞(HK2)以及乳腺癌细胞(4T1)的毒性。实验前,取适量CuS纳米粒放入透析袋(MWCO=14000)中,透析24 h以除去杂质。取对数生长期细胞,调整HK2细胞浓度为1×105 cells/ml,4T1细胞浓度为5×104 cells/ml,将100 μl/孔的细胞悬液接种于96孔细胞培养板,置于37 ℃,5% CO2培养箱中。孵育24 h后,每孔加入10 μl不同浓度的CuS纳米粒,使终浓度分别为3.1、6.3、12.5、25、50、100、150及200 μg/ml,继续培养24 h后,去除96孔板中培养基,加PBS洗涤2次(以排除Cu2+对CCK-8试剂的影响),每孔加入100 μl培养基及10 μl CCK-8试剂,于培养箱中孵育4 h后,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值(A)。参照公式:
细胞活力(%)=(A加药−A空白)/(A0加药−A空白)×100%,
计算细胞活力百分率,其中A加药指具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度,A空白指具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度,A0加药指具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
结果显示(图8),CuS纳米粒分别在100 μg/ml及150 μg/ml浓度范围内,对4T1乳腺癌细胞以及HK2肾细胞均无显著的细胞毒性(细胞活力大于80%),表明CuS纳米粒具备良好的生物相容性。
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考察CuS纳米粒的光热效应对4T1细胞的杀伤作用。取对数生长期细胞,调整4T1细胞浓度为5×104 cells/ml,将200 μl/孔细胞悬液接种于96孔细胞培养板,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养24 h后,去除全部培养基,加入200 μl含CuS纳米粒的培养基(CuS纳米粒的浓度为50 μg /ml)。采用1 W/cm2的近红外光,照射不同时间(0、1、3、5、7、10 min),随后采用CCK-8试剂测定细胞活力百分率,参照“2.5.1”项下公式计算。结果显示(图9),近红外光照射1 min对4T1细胞的活力无明显影响,继续延长照射时间,细胞活力呈显著的降低趋势,照射10 min后的细胞活力仅为28.76 %。
采用与上述相同的方法,改为6孔板,经980 nm近红外光(1 W/cm2)照射10 min后,加入0.2 %台盼蓝对死细胞进行染色(2 min)。去除染液并用PBS清洗2遍后,在倒置相差显微镜下进行观察。如图10所示,激光照射区域,细胞被染为蓝绿色,且显示了明显的边界,而对照组不加CuS纳米粒,仅给予近红外光照射,只有个别零散的细胞着色。图9与图10结果均表明CuS纳米粒对肿瘤细胞具有显著的光热杀伤效果。