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金线莲Anoectochilus roburghii (Wall.) Lindl,又名金线兰、金蚕、乌人参、金线入骨消等,是一种多年生兰科草本植物[1],主产地为福建。文献报道多糖类、黄酮类、生物碱类、氨基酸类等是金线莲主要化学成分[2]。其中金线莲多糖是其主要药理活性物质,具有降血糖、抗氧化、抗肝损伤、增强免疫功能、抗肿瘤等药用功效[3]。本研究为提高金线莲多糖提取率,采用超声提取的方法,在单因素实验的基础上以响应面法优化其提取工艺。蛋白质的存在往往影响到多糖的活性,蛋白的脱除是多糖提取纯化的一个关键步骤[4],且天然植物中多糖与蛋白质两种高分子成分分子量相近,严重制约了进一步的分析[5],而Sevage试剂法、三氯乙酸(TCA)法、盐法(氯化钙和氯化钠法)、盐酸法等是多糖脱蛋白的常用方法[4-6],为此,笔者对以上方法在金线莲多糖提取中的影响进行了考察,为进一步深入研究金线莲多糖奠定一定的基础。
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取D-葡萄糖50 mg溶于1000 ml的量瓶中,加水定容,得对照品溶液。
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取金线莲鲜品清洗干净,于60 ℃恒温干燥箱中烘干,打粉,过60目筛,得金线莲干品。取金线莲粉末5 g,以料液比为1:10加水,48 ℃超声提取30 min,超声功率为300 W,超声提取2次;对上述提取液3600 r /min离心15 min,弃去沉淀,即得金线莲原始液。取上述原始液5 ml加4倍体积无水乙醇放置过夜,4000 r/min下离心10 min,沉淀加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得供试品溶液。
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按本课题先前研究的“优化的苯酚硫酸法”[7],计算金线莲多糖提取得率。
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按“2.2”项下的方法,对超声提取工艺中各单因素进行考察:①以超声温度30、40、50、60、70、80 ℃分别进行提取;②以超声功率200、250、300、350、400 W分别进行提取;③用超声分别提取10、20、30、40、50 min;④以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30的料液比加水;⑤用超声分别提取1、2、3次。
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在单因素考察的基础上,利用软件Design-Expert.V8.0.6.1中Box-Behnken试验原理,选择对多糖提取率影响较大3个因素料液比(A)、超声提取时间(B)、超声温度(C)为自变量,以多糖提取率(R)为响应值,设计3因素3水平实验。因素与水平设计如表1。
因素 水平 −1 0 1 料液比(A) 5 10 15 超声时间(B) 20 30 40 超声提取温度(C) 40 50 60 -
取5 ml金线莲原始液,用2 mol/L盐酸调节至pH 3,并保持过夜。将该混合物在4000 r/min下离心10 min,弃去沉淀,上清液加入4倍体积无水乙醇放置过夜,4000 r/min下离心10 min,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。
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取5 ml金线莲原始液,以2% NaOH溶液将其调至pH 8~9,加热至85 ℃。将CaCl2固体调至5%(50 g/L)的浓度,煮沸30 min,冷却至室温并过滤,用稀盐酸将滤液调至pH 7,加入4倍体积无水乙醇放置过夜,4000 r/min下离心10 min,得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。
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取5 ml金线莲原始液,在沸腾(90 ℃)条件下,用2%NaOH溶液将多糖溶液调节到pH 9~10。加入NaCl固体,浓度调至5%(50 g/L),然后混合煮沸30 min。冷却至室温并过滤,上清液用稀盐酸调至pH 7。添加4倍体积无水乙醇放置过夜沉淀多糖,在4000 r/min下离心10 min,弃上清液得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。
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取5 ml金线莲原始液,加入10% TCA溶液将其调节到pH 3,静置过夜。样品4000 r/min离心10 min,沉淀物丢弃,上清液加4倍体积无水乙醇放置过夜,在4000 r/min下离心10 min,弃去上清液得多糖沉淀。加水溶解重复上述操作3次,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。
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取5 ml金线莲原始液,以金线莲水提溶液:正丁醇:氯仿按1:1:4的比例进行除蛋白,振荡器振荡20 min 后,4000 r/min 转速离心 5 min,弃去下层有机相。该过程重复3次,上层水相添加4倍体积无水乙醇放置过夜,在4000 r/min下离心10 min,弃去上清液得多糖沉淀物,所得沉淀物加水溶解,于1000 ml的量瓶中定容,得脱蛋白供试品溶液。
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以“紫外分光光度法”对蛋白含量进行测定[5],
蛋白质浓度C(mg/ml) = 1.45A280−0.74A260
多糖损失率=[(供试品多糖含量-脱蛋白供试品多糖含量)/供试品多糖含量]×100%
蛋白脱除率=[(供试品蛋白含量-脱蛋白供试品蛋白含量)/供试品蛋白含量]×100%
2.1. 对照品溶液的制备
2.2. 供试品溶液的制备
2.3. 金线莲多糖含量
2.4. 单因素实验
2.5. 响应面法优化超声提取工艺
2.6. 脱蛋白方法的考察
2.6.1. 盐酸法脱蛋白[4,6]
2.6.2. NaOH-CaCl2法脱蛋白[5]
2.6.3. NaOH-NaCl法脱蛋白[5]
2.6.4. 三氯乙酸(TCA)法脱蛋白[5]
2.6.5. Sevage法脱蛋白[6]
2.7. 多糖损失率与蛋白脱除率
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参考相关文献,按“2.2” 项下使用不同提取方法制得对应的供试品,比较多糖得率,结果如表2。
实验结果表明,超声提取和酶提取均能获得较高的多糖提取率,由于酶价格昂贵,超声提取操作简便,且能获得高提取率,故选择超声提取进行下一步研究。
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如图1所示:①随着提取温度的增加,提取得率逐渐增加,在50 ℃提取得率达到最大值,后随着温度的增加提取率逐渐下降并趋于稳定,故初步确定提取温度40~60℃作为进一步响应面考察设计的水平;②在超声功率为300 W时多糖提取率最高,实验结果显示,随着超声功率的增加,多糖提取率先上升后下降,但影响相对较小,故选定功率为300 W进行下一步分析;③以超声提取30 min,提取率最高,故初步确定超声时间20~40 min作为进一步响应面考察设计的水平;④料液比为1∶10时,多糖提取率最高,随着料液比的增加,提取率稍有下降且趋于平稳,故初步确定料液比1∶5~1∶15作为进一步响应面考察设计的水平;⑤随着提取次数的增加,提取率逐渐降低,提取3次后,多糖已基本提取完全,考虑实际操作及原料等,选定提取2次进行下一步分析。
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在单因素考察的基础上,利用软件Design-Expert. V 8.0.6.1中Box-Behnken试验原理,设计3因素3水平实验。响应值设计方案及结果见表3,方差分析见表4。对数据分析后得到回归方程为:
实验号 A B C 多糖提取率(%) 1 −1.000 0.000 −1.000 12.22 2 1.000 0.000 −1.000 10.16 3 0.000 1.000 −1.000 13.13 4 0.000 0.000 0.000 13.03 5 1.000 0.000 1.000 12.98 6 0.000 −1.000 −1.000 10.86 7 −1.000 −1.000 0.000 11.19 8 0.000 0.000 0.000 13.21 9 0.000 1.000 1.000 12.28 10 0.000 −1.000 1.000 12.25 11 −1.000 1.000 0.000 11.88 12 1.000 −1.000 0.000 11.08 13 0.000 0.000 0.000 13.12 14 0.000 0.000 0.000 12.85 15 −1.000 0.000 1.000 10.83 16 1.000 1.000 0.000 12.11 17 0.000 0.000 0.000 13.21 来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 15.41 9 1.71 51.68 < 0.0001 A 5.513×10−3 1 5.513×10−3 0.17 0.6955 B 2.02 1 2.02 60.98 0.0001 C 0.49 1 0.49 14.64 0.0065 AB 0.029 1 0.029 0.87 0.3814 AC 4.43 1 4.43 133.76 < 0.0001 BC 1.25 1 1.25 37.87 0.0005 A2 4.65 1 4.65 140.33 < 0.0001 B2 0.92 1 0.92 27.87 0.0011 C2 0.99 1 0.99 29.99 0.0009 残差 0.23 7 0.033 失拟项 0.14 3 0.047 2.07 0.2463 纯误性 0.091 4 0.023 总离性 15.64 16 多糖提取率(R)=13.08+0.026A+0.50B+0.25C+0.085AB+1.05AC−0.56BC−1.05A2−0.47B2−0.49C2。
由表3知,回归模型有很好的显著性(P< 0.0001),说明二项式方程拟合良好,模型二项式方程失拟项不显著(P=0.2463),说明未知因素对实验干扰较小,拟合的相关系数r=0.9926,模型可信度良好,故可运用此模型实现超声提取金线莲多糖最佳工艺的分析探究。
根据拟合方程绘制响应面图谱,响应面分析的等高线图和响应面图(图2、图3),AC、BC具有相互影响,各图为料液比(A)、超声时间(B)、超声提取温度(C)中任意一个变量取零水平,其余变量对金线莲多糖提取率的交互作用影响。由图2、图3可以看出,提取时间对提取率影响最为显著,三者的主效应关系为:提取时间(B)>提取温度(A)>料液比(C),其中料液比与提取温度的响应曲面最为陡峭,证明料液比与提取温度的交互作用最为强。
通过Design-Expert. V 8.0.6.1软件对二项式回归方程进行最优值的计算,确定理论上的多糖提取最佳工艺:料液比为1∶9.88,超声提取温度为48.76 ℃,超声提取时间为36.08 min,超声提取次数为2次,超声功率为300 W,其多糖提取的理论得率为13.22%,考虑到实际操作的可行性,最佳工艺定为料液比1∶10,超声提取温度48 ℃,超声提取时间36 min,超声提取次数为2次,超声功率为300 W。为验证实验结果,进行3组平行实验,多糖提取得率分别为13.14%、13.05%、13.20%,其RSD为0.57%,提取得率的均值13.13%与理论值13.22%偏差0.09%,表明优化后的提取工艺可行,适用于金线莲中多糖的提取。
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按“2.6”项下的方法进行脱蛋白操作,得出多糖损失率及蛋白脱除率结果如表5。实验结果表明,NaOH-CaCl2法脱蛋白可以获得较高蛋白脱除率,同时也能获得最低的多糖损失率。