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丙硫氧嘧啶(propylthiouracil),为硫脲类化合物,它可通过抑制甲状腺内过氧化物酶系统,阻止酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的缩合,从而抑制甲状腺激素的合成,是临床常用的治疗甲亢的药物[1-3]。其口服吸收迅速,约1~1.5 h达血药浓度峰值;代谢快,24 h内约有35%的药物以原型和葡萄糖醛酸化物的形式从尿中排出,血浆半衰期约为1~3 h[4]。口服丙硫氧嘧啶个体差异较大,由于其血浆蛋白结合率高(约为80%),且存在肝毒性,因此对其进行血药浓度监测,能使药物应用更为安全合理[5-6]。进口丙硫氧嘧啶的价格昂贵,研发高质量、低价格的国产仿制药具有良好的经济效益和社会效益[7],开发高效稳定的丙硫氧嘧啶的血药浓度测定方法,可为仿制药一致性评价中的生物等效性试验(BE)提供依据。
目前,丙硫氧嘧啶的体内测定方法主要为高效液相色谱法(HPLC)[8-10],早期开发的液相测定方法,分析时间长,专属性和灵敏度均无法满足临床高通量测定的需求,因此,建立简单快速、灵敏准确的丙硫氧嘧啶血药浓度质谱分析方法(MS)具有重要意义。本文建立UPLC-MS/MS法测定人血浆中丙硫氧嘧啶的含量,可为临床治疗药物监测(TDM)和生物等效性试验(BE)提供方法学基础。
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色谱柱为Agilent SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液(80∶20,V/V),等度洗脱;流速:1 ml/min,柱后分流比2∶3;柱温30 ℃;进样量5 μl,分析时间3min。
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采用AJS-ESI源,正离子模式,离子源参数:干燥气温度350 ℃;干燥气流速10 L/min;雾化器压力40 psi;鞘气温度350 ℃;鞘气流速11 L/min;毛细管电压4 000 V。多反应监测(MRM)的参数:丙硫氧嘧啶m/z 171.1→112.1,碎片电压110 V,碰撞能量30 eV;丙硫氧嘧啶-D5(IS)m/z 176.1→117.0,碎片电压110 V,碰撞能量30 eV。丙硫氧嘧啶和氘代内标的保留时间均为1.9 min。
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精密称取丙硫氧嘧啶对照品1.5mg,置于2 ml称量瓶中,用移液器(已校准)加入甲醇适量溶解,涡旋混匀,配成1.0 mg/ml的对照品储备液;取上述对照品储备液适量,用甲醇逐级稀释,配成浓度分别为200、500、1000、2 000、10 000、20 000、40 000、80 000、100 000 ng/ml的系列对照品溶液,置4 ℃冰箱保存,备用。
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精密称取丙硫氧嘧啶-D5对照品1.3mg,置于2 ml称量瓶中,用移液器(已校准)加入甲醇适量溶解,涡旋混匀,配成1.0 mg/ml的内标储备液;取上述储备液适量,用乙腈(含5%甲酸)稀释400倍,得2 500 ng/ml的内标溶液,置于4 ℃冰箱保存,备用。
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取空白血浆950 μl,精密加入“2.2.1”项下制备的丙硫氧嘧啶系列标准溶液50 μl,旋涡混匀,配成浓度分别为10、25、50、100、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng/ml的标准含药血浆。同法制备4个浓度的质控样品(QC),分别为10、25、500、4 000 ng/ml,待用。
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血浆样品先置于室温下解冻,取100 μl血浆,依次加入200 μl内标溶液,200 μl乙腈(含5%甲酸),涡旋1min,于4 ℃下13000×g高速离心10 min,取100 μl上清液于进样瓶中,进行UPLC-MS/MS分析。
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通过比较6个不同健康志愿者的空白血浆样品、质控样品和给药后实际样品的色谱图来评估。分别取空白血浆、质控样品(QC-L)和受试者给药后的血样各100 μl,按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作,进样,获得样品的色谱图(图1),包括空白样品色谱图、质控样品色谱图和实际样品色谱图。结果显示,空白血浆中的内源性成分不干扰待测物和内标出峰,选择性良好。
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取“2.2.3”项下制备的标准含药血浆样品100 μl,按“2.3”项下血浆样品前处理方法操作,进样分析,记录色谱图。以待测物血浆浓度为横坐标(X),待测物与内标峰面积比为纵坐标(Y),进行回归,使用1/X 加权,求得回归方程: Y=0.000 4X−0.000 2(r=0.999 3)。结果表明,血浆中的丙硫氧嘧啶在10~5 000 ng/ml范围内线性关系良好。以S/N>10确定,定量下限(LLOQ)10 ng/ml,为标准曲线最低点。
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在LLQQ(10 ng/ml)、QC-L(25 ng/ml)、QC-M(500 ng/ml)、QC-H(4 000 ng/ml)4个浓度下,通过批内和批间分别考察。按“2.2.3”项下制备丙硫氧嘧啶4个浓度质控样品,每个浓度平行5份,按“2.3”项下血浆样品前处理操作,进样分析。并于每天制备4个浓度质控样本各5份,进样分析,连续3 d,计算批内、批间的精密度(RSD)及准确度(RE),批内和批间的RSD<10%, RE<±10%,结果见表1。
浓度(ng/ml) 批内(n=5) 批间(n=15) 精密度(RSD/%) 准确度 (RE/%) 精密度(RSD/%) 准确度(RE/%) 10 3.40 −0.55 8.38 −0.88 25 8.35 −5.59 9.53 1.63 500 7.61 −1.00 6.21 −3.39 4 000 2.90 −2.79 4.71 −5.95 -
取6位健康志愿者的空白血浆,在相当于QC-L(25 ng/ml)和QC-H(4000 ng/ml)的2个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清,然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液,以使其终浓度与处理后QC-L和QC-H一致;同时制备相同浓度不含基质的待测物和内标的乙腈溶液,进样分析。通过峰面积分别计算待测物和内标的基质因子,进一步得到经内标归一化的基质因子。不同基质下,2个浓度基质效应的变异系数均小于5%,符合方法学要求,结果见表2。
浓度(ng/ml) 待测物
基质因子(%)内标
基质因子(%)归一化
基质因子(%)变异系数(%) 25 25.94 23.99 108.18 1.78 4 000 21.91 21.92 100.62 0.66 -
取单一来源的空白血浆,在相当于QC-L(25 ng/ml)、QC-M(500 ng/ml)、QC-H(4 000 ng/ml)的3个浓度下来考察。先按“2.3”项下血浆样品前处理方法制备空白基质上清,然后加入丙硫氧嘧啶及内标的标准溶液,以使其终浓度与处理后QC-L、QC-M、QC-H一致;同时按“2.2.3”和“2.3”项下制备和处理3个浓度的QC样品,每个浓度平行操作5份,分别进样分析。通过峰面积计算待测物的提取回收率,平均回收率为101.60%~113.56%,结果见表3。
被分析物 浓度(ng/ml) 回收率(%) RSD(%) 丙硫氧嘧啶 25 101.60 5.30 500 113.56 1.72 4 000 108.82 6.26 -
首先通过新鲜配制丙硫氧嘧啶和内标的储备液1.0 mg/ml,考察对照品储备液于4 ℃下放置30 d的稳定性,结果显示,RE<±10%,稳定性良好。然后在QC-L(25 ng/ml)、QC-H(4 000 ng/ml)2个浓度下,分别考察4种条件下丙硫氧嘧啶的稳定性:室温放置4 h、自动进样器(4 ℃)放置24 h,冻融循环3次,以及−80 ℃下冻存30 d,每个浓度平行操作5份。按“2.3”项下血浆样品前处理操作,进样分析,将丙硫氧嘧啶和内标峰面积的比值代入随行标准曲线求得实测浓度,计算RE以及RSD,结果(见表4)显示稳定性良好。
浓度(ng/ml) 室温放置4h 4 ℃放置24h 冻融循环3次 −80 ℃冻存30 d RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) RE(%) RSD(%) 25 2.82 6.58 1.99 6.00 4.67 4.85 8.17 5.59 4 000 −4.65 6.24 −7.70 4.51 4.82 3.90 3.73 1.93 -
通过在定量上限(ULOQ)5 000 ng/ml完成测定之后立即测定空白样品来评估。结果显示,分析物保留时间处峰面积小于LLOQ的20%,IS保留时间处的峰面积小于实际IS的5%。该方法几乎无残留,不影响测定。
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通过使用空白基质将定量上限(ULOQ)10倍(50 000 ng/ml)和50倍(250 000 ng/ml)浓度的样品稀释至定量范围(10~5 000 ng/ml)来评估,每个浓度平行操作5次。结果表明,RSD和RE均低于15%,样品稀释不影响测定的精密度和准确度。