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颅内感染尤其是多重耐药菌感染具有进展快、反应重、治疗难度大、病死率高的特点,故提高颅内感染治愈率受到患者及临床的广泛关注。替加环素(TGC)作为首个甘氨酰四环素类抗菌药物,具有抗菌谱广、抗耐药活性强的特点,对临床上常见耐药菌(如鲍曼不动杆菌、产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等)均有较好的疗效[1]。在耐药菌治疗药物不足的情况下,临床医生将TGC用于颅内感染的治疗,此外,越来越多的案例报道称,TGC可有效清除致病菌[2-3]。
TGC成功治疗颅内感染与脑脊液中有效药物浓度密切相关,TGC浓度监测对于提高颅内感染治愈率、精准指导临床合理用药具有重要意义[4]。本研究将利用二维液相色谱高效的自动化在线样品处理能力,建立脑脊液中TGC浓度测定方法。该方法与已报道的质谱法相比,具有操作简便、成本低、抗干扰能力强、基质效应小等优势,脑脊液样品无需复杂的前处理,高速离心后直接进样,短时间内即可完成萃取、转移及分析,更易于临床推广应用。
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精密称取TGC对照品1.29 mg,用20 mg/ml精氨酸水溶液定容至100 ml容量瓶中,即得12.90 μg/ml的TGC标准溶液。
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预处理方法考察时,取脑脊液样品500 μl,直接离心、分别加入3倍体积甲醇、乙腈、10%高氯酸沉淀蛋白,涡旋混匀5 min,13 000 r/min离心10 min,取上清液进样分析。最终确定预处理方法为: 脑脊液样品13 000 r/min离心10 min后直接进样,采用外标法定量分析。
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第一维色谱柱LC1为Aston SNX5苯基色谱柱(50 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为磷酸铵(氨水调pH7.5)-甲醇 (45∶55,V/V),第二维色谱柱LC2为Aston SC5 C18色谱柱(275 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为磷酸铵(氨水调pH7.4)-磷酸铵(氨水调pH3.0)-乙腈(30∶50∶20,V/V/V),辅助流动相为纯化水。检测波长340 nm,色谱柱温40 ℃,进样量:200 μl,工作原理图见图1,时间程序见表1。
时间(t/min) 流速(ml/min) 功能 LC1 LC2 辅助流动相 0.01~0.80 1.00 1.20 2.00 脑脊液样品于LC1中富集 0.81~3.49 1.00 1.20 0.01 目标物在LC1中初步分离 3.50~5.50 1.00 1.20 0.01 LC1与LC2串联,目标物洗脱至LC2 5.51~11.00 1.50 1.20 0.01 目标物在LC2中洗脱分离,清洗泵反向冲洗LC1 -
分别制备空白脑脊液样品、含TGC的标准脑脊液样品、患者用药后的脑脊液样品,进行二维液相分析,得到色图谱,观察有无内源性干扰,如图2所示。结果表明,TGC的出峰时间9.38 min,脑脊液的内源性成分对TGC的测定无干扰。
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取不同体积TGC标准溶液,加入空白脑脊液定容,配制成浓度为64.5、129.0、387.0、645.0、1 290.0 ng/ml的系列对照溶液,按“2.2”项下操作后进样分析。以TGC浓度为自变量(X),脑脊液中TGC的峰面积为因变量(Y)进行线性回归,得回归方程为:Y=116.32X-3 223.6(r=0.999 8)。结果表明TGC浓度在64.5~1 290.0 ng/ml范围内线性关系良好,最低定量限为64.5 ng/ml。
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分别配制含TGC低、中、高及定量下限(225.0、450.0、900.0、64.5 ng/ml)4个浓度的质控(QC)脑脊液样本,按“2.2”项下操作后进样分析。1 d内每个浓度平行测定5份QC样品,连续测定3 d。将测得的峰面积代入“2.4.2”项下,计算各质控样品的浓度,并根据样本实际浓度计算本法的精密度与准确度。结果如表2所示,日内、日间RSD均小于5%,准确度均在98.80%~106.51%之间。可见本实验所建立的二维液相色谱法测定脑脊液中TGC的精密度和准确度符合《中国药典》(2015年版)检测要求[5]。
浓度(ng/ml) 日内(n=5) 日间(n=3) 准确度 RSD 准确度 RSD 225.0 100.31 ± 2.83 2.82 98.80 ± 0.95 0.96 450.0 104.58 ± 2.19 2.09 103.51 ± 2.72 2.63 900.0 106.51 ± 2.06 1.94 101.82 ± 4.28 4.20 64.5 105.04 ± 2.47 2.35 99.01 ± 2.05 2.08 -
配制“2.4.3”项下低、中、高及定量下限4个浓度的QC样品,每个浓度平行3份,分别考察室温放置4 h、进样器放置6 h、反复冻融3次、冰冻放置1周后的稳定性。结果如表3所示,表明上述条件对TGC的检测结果无明显影响。
样品浓度(ng/ml) 室温放置4 h 进样器放置6 h 反复冻融3次 冰冻放置1周 平均浓度(ng/ml) RSD(%) 平均浓度(ng/ml) RSD(%) 平均浓度(ng/ml) RSD(%) 平均浓度(ng/ml) RSD(%) 64.5 68.67 ± 2.93 4.27 65.52 ± 1.52 2.32 65.01 ± 1.43 2.20 68.56 ± 3.06 4.46 225 223.16 ± 5.06 2.27 221.62 ± 2.45 1.11 224.72 ± 4.50 2.00 222.99 ± 5.40 2.42 450 452.44 ± 9.11 2.01 459.04 ± 13.45 2.93 464.03 ± 8.39 1.81 459.68 ± 8.25 1.80 900 885.14 ± 15.09 1.70 881.32 ± 13.36 1.52 888.13 ± 13.80 1.55 899.79 ± 10.13 1.13 -
本实验选取2例接受TGC治疗的多重耐药菌所致的重症颅内感染患者,脑脊液标本药敏试验均报告对TGC敏感。患者1接受说明书推荐剂量,即首剂静脉滴注100 mg,后以50 mg每12 h维持治疗。患者2同样接受静脉给药,剂量为受试者1的2倍。达到稳定药物浓度后,留取两位受试者的脑脊液,按“2.2”项下操作后进样分析。受试者脑脊液中TGC浓度分别为187.42、275.41 ng/ml。