Identification of chemical components and monosaccharide assay in Nocardia rubra cell wall skeleton

安捷伦-1290 Infinity高效液相色谱系统-电喷雾离子源（安捷伦，Palo Alto, CA, USA）串联安捷伦6538四级杆-高分辨飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS），安捷伦-1290 Infinity高效液相色谱系统-电喷雾离子源（安捷伦，Palo Alto, CA, USA）串联安捷伦6460三重四级杆质谱（UHPLC-MS/MS），AMIDE色谱柱（3.0 mm×100 mm，3.5 µm，Waters，USA），Waters Xbridge C₁₈色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，Milli-Q50 SP纯水制备系统制备（Millipore Corporation, MA, USA），电热干燥箱（上海恒科仪器有限公司，DHG-9145AZ）。

Nr-CWS提取物（辽宁格瑞士特生物科技有限公司，按照产品工艺提取）；Sephadex G-100（国药集团化学试剂有限公司）；D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖（纯度>98%，国药集团化学试剂有限公司）；三氟乙酸(TFA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，国药集团化学试剂有限公司）；HPLC色谱级甲醇、乙腈（默克公司，Darmstadt, Germany）；乙醇、甲酸（Fluka公司，Buchs, Switzerland）。

UHPLC-Q-TOF/MS分析在安捷伦1290 Infinity 液相色谱系统和安捷伦6538四极杆-高分辨飞行时间串联质谱仪(Agilent，USA)上进行，色谱分离在Amide色谱柱上进行（3.0 mm×100 mm，3.5 µm，Waters，USA），柱温40 ℃，流动相A为0.1 %甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，流速0.4 ml/min，流动相采用梯度洗脱，洗脱条件为：0~1 min，5 % A；1~5 min，5 %~20 % A；5~20 min，20%~45 % A；20~30 min，45 % A，进样量为5 µl，自动进样器温度保持在25 ℃。电喷雾离子源（ESI）采用正、负离子模型。Q-TOF/MS质谱参数如下：毛细管电压，正离子模式下4 kV，负离子模式下3.5 kV；干燥器流速11 L/min；气体温度350 ℃；雾化器压力45 psig；碎片电压120 eV；Skimmer电压60 eV。质谱的采集范围m/z 50~1100，分析碰撞能量10~40 eV。

取Nr-CWS提取物溶于1 ml纯水中，充分涡旋溶解后制成Nr-CWS提取物母液，取100 µl于1.5 ml EP管中，加入3倍量的乙醇进行蛋白沉淀。然后4 ℃下13 000 r/min离心15 min，吸取200 µl上清液，于进样瓶中用于UHPLC-Q-TOF/MS分析。

采用UHPLC-Q-TOF/MS分析方法对Nr-CWS提取物样品溶液进行快速地分离与分析，获得正、负离子模式下的总离子流图，通过与Metlin数据库中代谢物信息比对分析，可对Nr-CWS提取物中化学成分进行快速分析与鉴别，结果如图1和表1所示。

准确称取D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖各10 mg，分别置10 ml 容量瓶，各加水定容，即得1 mg/ml浓度的各单糖标准品溶液。分别精密取上述单糖标准品溶液，混合后加重蒸水稀释，制成100 μg/ml的单糖混合标准溶液。

精密称取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)1.0 g，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制得0.5 mol/L的PMP 甲醇溶液。

精密吸取单糖及混合标准品溶液100 μl置2 ml EP管中，添加100 μl氨水，再加入100 μl 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，涡旋30~45 s，于70 ℃烘箱中加热30 min，取出放冷至室温。加入100 μl乙酸，涡旋30 s中和，加重蒸水至1 ml，再加500 μl氯仿，涡旋30 s，混匀，弃去下层溶液，重复3 次，12 000 r/min离心10 min，水层经0.22 μm微孔滤膜滤过，取次滤液用于UHPLC-MS/MS分析，见表2。

UHPLC-MS/MS分析采用安捷伦1290 Infinity 液相色谱系统和安捷伦6460三重四极杆串联质谱仪(Agilent，USA)。色谱分离在Waters Xbridge C₁₈色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃，流动相A为20 mmol/L的乙酸铵水溶液（氨水调pH 8.0），流动相B为乙腈溶液，流速0.4 ml/min，流动相采用梯度洗脱，洗脱条件为：0~2 min，15%~20% B；2~4 min，20%~25% B；4~5 min，25%~95 % B，5~6 min，15 % B，样品分析时间5 min，柱后平衡时间1 min。进样量为2 µl，自动进样器温度保持25 ℃。三重四级杆质谱条件为：电喷雾离子源（ESI）采用负离子，多级反应选择离子监测模式：毛细管电压3.5 kV；干燥器流速11 L/min；气体温度350 ℃；雾化器压力40 psig；碎片电压80 eV；Skimmer电压60 eV。

精密吸取Nr-CWS提取物溶液1 ml，加入2 mol/L的TFA 2.0 ml，放入110 ℃的真空干燥箱中，酸性条件下水解6 h，冷却至室温，4 ℃条件下离心干燥，挥发三氟乙酸，加重蒸水1 ml复溶，用于衍生化处理。

精密吸取Nr-CWS提取物的水解液100 μl，按照前述单糖衍生化方法进行前处理后，精密吸取前处理后的样品溶液2 μl进UHPLC-MS/MS分析，混合标准品和Nr-CWS样品衍生化后的UHPLC-MS/MS色谱图见图2。

精密吸取单糖混合标准品溶液，按前述单糖衍生化方法进行前处理后，精密吸取前处理后的样品溶液2 μl用UHPLC-MS/MS法分析，以各单糖峰面积与相应浓度进行线性回归分析，计算回归方程和相关系数，逐步稀释后，按照信噪比S/N=10和3，分别计算其定量限和检测限，结果见表3。

取经水解和衍生化反应后的单糖混合标准溶液，按照前述UHPLC-MS/MS分析测定条件，连续进样6次，计算其测定结果的RSD为3.13%，结果表明该方法的精密度良好，符合分析测定的要求。

Nr-CWS提取物溶液经水解和衍生化反应后，室温下放置，分别于0、5、l5、30、60、120 min进样，进行UHPLC-MS/MS分析，测定其浓度，对样品的稳定性进行评价，结果6次测定结果的RSD为7.63%，表明样品在2 h内稳定性良好，符合分析测定的要求。

取同一批样品，重复测定6次，计算其测定结果RSD为4.67%，表明该方法的重复性良好，符合分析测定的要求。

精密吸取已知含量的Nr-CWS提取物加入接近等量的单糖混合标准品溶液，经水解和衍生化反应后，进行UHPLC-MS/MS分析，计算其平均回收率为86.93%，RSD为9.15%，符合分析测定的要求。

精密吸取Nr-CWS提取物样品溶液6份，经水解衍生化后，按照前述UHPLC-MS/MS分析条件对衍生化后的样品进行分离分析，测定其中单糖的含量，结果见表4，可以看出8种单糖成分都能被检出，其中阿拉伯糖和半乳糖的含量最高。

Nr-CWS提取物中化学成分的分析鉴别，采用UHPLC-Q-TOF/MS分析方法对Nr-CWS提取物样品溶液进行快速地分离分析^[15-16]，获得正、负离子模式下的总离子流图，通过与Metlin数据库中代谢物信息快速地比对分析，共鉴别出Nr-CWS提取物中64个化学成分，其中包含氨基酸、脂肪酸、单糖、胞壁酸、粘肽等成分，说明Nr-CWS提取物中含有很多的细胞代谢产物，且以氨基酸、脂肪酸和糖类成分为主，这些成分就是Nr-CWS提取物发挥作用的主要成分。

由于Nr-CWS提取物中成分复杂，采用UHPLC-Q-TOF/MS方法直接对提取物进行分析，仅能检测到个别单糖成分，如木糖、半乳糖、葡萄糖等，说明Nr-CWS提取物中主要含有多糖成分，经水解衍生化后^[17-20]，采用UHPLC-MS/MS方法进行检测，8个单糖都能被检测到，且阿拉伯糖和半乳糖的含量最高，说明Nr-CWS中的多糖主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，这将为进一步的多糖成分分析鉴别奠定基础。

对单糖进行分析测定的方法有很多，我们通过比较衍生化和不衍生化方法的检测限和定量限，发现单糖衍生化后，其定量限和检测限更低，测定干扰更少，分析方法学验证结果表明，其精密度、重现性、稳定性和回收率均符合分析测定的要求。

本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS方法对Nr-CWS提取物中化学成分进行了快速地分离与分析，通过与Metlin代谢物成分数据库比对，共鉴别出Nr-CWS提取物中64个化学成分，主要包括氨基酸、糖类、脂肪酸等成分；对Nr-CWS提取物中糖类成分衍生化后，采用UHPLC-MS/MS分析方法对Nr-CWS提取物中8种单糖成分进行含量测定。结果表明，Nr-CWS中阿拉伯糖的含量最高，其次为半乳糖，说明Nr-CWS中发挥作用的主要多糖类成分可能主要由这几种单糖组成。通过本研究为后期开展Nr-CWS活性成分筛选及药理作用机制的研究奠定了基础。