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Wentilactone A(WA)是从海洋微生物中分离得到的去甲二萜类小分子化合物,对小细胞肺癌细胞系NCI-H460和NCI-H446细胞的增殖具有抑制作用,可诱导小细胞肺癌细胞系NCI-H446和NCT-H1688细胞凋亡[1]。对小细胞肺癌细胞系NCT-H1688细胞的细胞迁移和集落形成具有抑制作用[2]。WA作为一种有效抗肿瘤候选物,已从制备工艺、理化性质、急性毒性、生殖毒性等方面证明其良好的成药性[3]。遗传毒性安全性实验更是对其临床前研究全面性的补充,为提高临床用药的安全性,为了验证其是否具有遗传毒性,本实验应用微生物回复突变试验(Ames试验)、体外培养CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验方法对WA的遗传毒性进行了系统的研究,为WA的临床前毒性评价提供资料[4]。
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Ames试验用WA(含量:99.9%,批号:20121115,黄色粉末)、体外培养CHO细胞染色体畸变试验用(规格:10 ml,含量:50.8 mg/ml,批号:20130506,黄色澄明溶液)、小鼠骨髓微核试验用WA(规格:10 ml/支:100mg,含量:10.2 mg/ml,批号:20130407,黄色澄明溶液),均由海军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室提供。WA的化学结构见图1。
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组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌(S. typhimurium)TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5支菌株,复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室赠予。实验前对其进行鉴定(R因子和自发回变数鉴定),均符合规定标准。
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中国仓鼠卵巢(CHO)细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予。
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ICR小鼠(SPF级)共60只,每组10只,雌雄各半,5~6周龄,购入时体重16.5~20.8 g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,动物质量合格证号:2008001629237。自购入起3天进行检疫,给药时体重20.3~23.6 g。
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按《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》[5-6]的设计要求,分别应用Ames试验[7]、体外培养CHO细胞染色体畸变试验[8]和小鼠骨髓微核试验[9]检测WA的遗传毒性。检测终点覆盖了基因突变、染色体畸变和细胞有丝分裂异常。
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根据《药物遗传毒性研究技术指导原则》的要求,应用S. typhimurium TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5支菌株,设每皿5 000、500、50、5、0.5 μg 5个剂量组。此外,设空白对照、溶剂对照和阳性对照组(具体剂量见表1)。采用标准平板掺入法,使细菌在加和不加代谢活化系统S9的条件下接触受试物,每皿均加入供试品或溶剂对照DMSO 0.1 ml,每个剂量组及对照组均设3个平行皿。并用最低极限的琼脂培养基培养48 h后,先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况,确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用,再人工计数每皿回复突变的菌落数,记录原始数据,并计算每组的均值和标准差,与溶剂对照组进行比较,重复实验一次。
组别 菌株 阳性对照品 溶液终浓度(μg/皿) 加入量(μl/皿) 浓度(μg/ml) -S9组 TA97 敌克松 50 100 500 TA98 敌克松 50 100 500 TA100 甲基磺酸甲酯 1 100 10 TA102 甲基磺酸甲酯 1 100 10 TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物 0.5 100 5 +S9组 TA97 2-氨基芴 10 100 100 TA98 2-氨基芴 10 100 100 TA100 2-氨基芴 10 100 100 TA102 1,8-二羟基蒽醌 50 100 500 TA1535 环磷酰胺 50 100 500 -
在加和不加代谢活化系统S9的条件下,体外培养的CHO细胞中加入相应浓度的供试品或对照品,反应体系总体积为10 ml。低、中、高剂量组供试品终浓度分别为23.74、47.48和94.96 μg/ml,阳性对照组丝裂霉素C和环磷酰胺的终浓度分别为0.5 μg/ml、60 μg/ml,另设溶剂对照组分别作用于细胞4 h后换液继续培养至24 h,和药物作用细胞24 h后收集细胞。收获细胞前4 h,加入终浓度0.2 μg/ml秋水仙素,培养结束收集细胞,经离心、低渗处理、固定、离心、制片和Giemsa染色,每个剂量组制备2~3张玻片标本。
镜检时每组观察200个染色体中分散良好、数目完整的中期分裂相细胞(若观察到大量染色体畸变细胞,如阳性对照组,分析细胞数可相应减少为至少100个细胞)。计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目(裂隙和核内复制一般不作为畸变类型),记录原始数据计算畸变率。
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检疫期结束后分别按低、中、高组小鼠给药,分别予100、200、400 mg/kg剂量给药,其中高剂量组设两组分别在药物作用24 h和48 h后处死,并设阳性对照组和溶剂对照组。分别在药物作用24 h和48 h后处死小鼠,取股骨骨髓制成骨髓涂片,每只动物制2张涂片,经甲醇固定后用pH6.8的Giemsa染液染色。
每只动物镜检约2000个骨髓嗜多染红细胞(PCE),计数含微核的PCE数(MNPCE),计算微核发生率,同时记录200个PCE计数过程中观察到的正染红细胞(NCE)的数目,并计算PCE/NCE值。
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对于易溶无毒的化合物,细菌实验最高浓度应达到5 mg/皿[10]。Ames试验设每皿5 000、500、50、5、0.5 μg 5个剂量组,每皿均加入相应浓度的供试品溶液0.1 ml,另设空白对照、溶剂对照和阳性对照。在哺乳动物细胞体外遗传实验中,毒性水平应高于50%细胞抑制率或细胞融合率[11]。通过预实验确定供试品的IC50为94.96 μg/ml。染色体畸变试验的低、中、高剂量组为23.74、47.48和94.96 μg/ml,试验时在10 ml的试验体系中分别加入0.1 ml各剂量组的应用液,另设阳性对照组和溶剂对照。ICR小鼠的微核试验采用小鼠经尾静脉注射给药,总剂量分别为100、200、400 mg/kg(单次给药剂量分别为50、100、200 mg/kg,分上、下午两次经尾静脉注射给药),给药容积为20 ml/kg体重;同时设阳性对照组和溶剂对照组。阳性对照组以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射环磷酰胺,给药容量为10 ml/kg体重;溶剂对照组给药方式与受试物组相同,以20 ml/kg体重的容积经尾静脉注射生理盐水。
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Ames试验结果的评价是以溶剂对照组的回复突变菌落数为基础,与受试物各剂量组相比较。若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2倍以上,呈现可重复性,并在一定的剂量范围内存在着剂量-反应关系,则判断为阳性[12]。染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验均采用卡方检验或方差分析方法研究给药组与对照组之间是否具有统计学意义[13]。
1.1. 材料
1.1.1. 化合物WA
1.1.2. 菌株
1.1.3. 细胞
1.1.4. 动物
1.2. 试验方法
1.3. 实验步骤
1.3.1. Ames实验
1.3.2. 染色体畸变试验
1.3.3. 小鼠骨髓微核实验
1.4. 剂量设计
1.5. 统计方法
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受试物各剂量组和对照组的平皿均可见背景菌苔生长。5支菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史参考范围内,并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落与空白对照组相比数目显著增加,提示本试验系统符合要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下,未观察到受试物的抑菌现象。各剂量组受试物在加或不加S9时对TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535所诱发的回复突变菌落数均与自发的突变菌落数相近,未观察到明显的剂量-反应关系。结果见表2和表3。
组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 36±5 40±4 21±3 21±2 131±26 93±17 177±21 185±25 25±3 14±2 500 36±5 39±8 17±4 20±3 114±22 90±23 195±8 207±7 23±1 19±1 50 39±10 35±5 21±7 21±3 115±21 97±8 196±33 179±18 19±8 16±4 5 41±6 40±3 21±5 22±4 114±15 87±19 195±21 193±8 19±2 14±1 0.5 37±6 39±3 20±3 19±3 128±15 91±12 201±14 205±14 20±6 16±4 空白对照组 40±7 36±5 17±2 19±4 99±17 89±9 213±30 197±34 21±7 19±4 溶剂对照组 40±6 34±1 22±5 26±2 95±8 89±9 193±8 199±29 23±3 14±1 阳性对照组 839±24 841±47 936±56 1 077±55 968±27 1 111±66 1 101±17 1 024±53 342±44 345±13 组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 38±5 34±5 20±5 21±5 128±24 105±26 179±21 189±19 20±4 20±3 500 39±7 34±3 21±2 20±7 108±13 92±28 192±16 187±30 16±3 19±4 50 38±9 30±3 19±3 18±1 117±14 102±5 197±5 196±22 17±3 18±1 5 37±8 29±4 18±2 17±1 111±5 98±33 206±24 191±21 16±1 20±2 0.5 35±6 33±8 24±2 23±3 107±7 97±8 203±6 193±10 15±4 15±4 空白对照组 38±3 41±4 22±3 23±4 96±12 93±8 205±17 186±19 18±2 18±4 溶剂对照组 38±3 37±8 22±3 23±4 98±7 100±12 202±15 197±10 18±2 19±4 阳性对照组 881±18 876±35 900±11 1 077±111 964±113 996±8 1 024±37 1 011±8 392±8 392±22 -
染色体分析结果显示,阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高,24 h在+ S9和-S9的情况下染色体畸变率分别为11%和11%,与溶剂对照组相比,均有统计学差异(P<0.05);23.74、47.48和94.96 μg/ml受试物在24 h、+S9条件下染色体畸变率分别为1%、1%和0.5%,24 h、-S9条件下染色体畸变率分别为0%、0.5%和0%;4 h、-S9条件下染色体畸变率分别为0%、0%和0%。综上,受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%,与溶剂对照组结果相比,其差异均无统计学意义(P>0.05)。结果见表4~6。
组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 1 1 0 0 0 0 0 1 2 1 47.48 μg/ml 200 2 2 0 0 0 0 0 0 2 1 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 溶剂对照组 200 200 0 0 0 0 0 3 3 3 1.5 阳性对照组 100 9 0 0 1 3 3 0 0 14 14 注:阳性对照组:+S9、环磷酰胺(60 mg/ml);溶剂对照组:DMSO;* P<0.05,与溶剂对照组比较。 组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.48 μg/ml 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶剂对照组 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 阳性对照组 100 4 4 0 0 0 0 4 0 12 12* 注:阳性对照组:-S9、丝裂霉素C(0.5 mg/ml);溶剂对照组:DMSO;*P<0.05,与溶剂对照组比较。 组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.48 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶剂对照组 200 阳性对照组 * P<0.05,与溶剂对照组比较。 -
试验结果经统计学分析表明,WA在100、200、400 mg/kg剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用,溶媒对照组和阳性对照组雌、雄性小鼠骨髓PCE微核发生率分别为2.10‰和21.36‰、1.90‰和20.88‰,两组相比差异均有统计学意义(P<0.05),验证了本次试验系统的有效性。WA 100和2 000 mg/kg剂量24 h采样组雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分别为1.60‰和1.80‰、1.90‰和1.60‰;400 mg/kg剂量24 h和48 h采样组雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分别为2.10‰和2.80‰、2.40‰和1.29‰,与溶媒对照组相比均无显著差异(P>0.05)。结果见表7。
组别 性别 动物数(只) 观察PCE数(个) PCE/NCE(${\rm{\bar x}}$±s) 微核率(${\rm{\bar x}}$±s, ‰) 100 mg/kg 雌 5 10 020 2.40±0.89 1.60±0.96 200 mg/kg 雌 5 10 010 1.63±0.40 1.80±1.31 400 mg/kg (24 h采样) 雌 5 10 016 1.95±0.40 2.10±1.20 400 mg/kg (48 h采样) 雌 5 10 009 1.58±0.44 2.80±1.81 溶媒对照组 雌 5 10 009 2.37±0.69 2.10±1.20 阳性对照组 雌 5 9 095 2.18±0.30 21.36±7.84* 100 mg/kg 雄 5 10 016 1.56±0.30 1.90±1.28 200 mg/kg 雄 5 10 009 1.52±0.28 1.60±0.70 400 mg/kg (24 h采样) 雄 5 10 006 1.40±0.73 2.40±2.01 400 mg/kg (48 h采样) 雄 5 8 802 1.43±0.63 1.29±1.26 溶媒对照组 雄 5 9 029 2.13±0.58 1.90±1.45 阳性对照组 雄 5 10 011 1.62±0.42 20.88±4.94* *P<0.05,与溶剂对照组比较。