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益母草(Leonurus japonicus Houtt.)作为传统中药,以往主要用于治疗妇产科疾病。近年来的研究发现,益母草中的主要化学成分为生物碱、类黄酮和二萜等[1],其中,益母草碱(4-胍基-正丁基-丁香酸酯,又名SCM-198)是一种具有抗血小板聚集[2]、改善微循环、保护心肌[3-4]等多种生物活性的重要生物碱,有广泛的临床应用前景[5-7]。本研究采用SD大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验方法对益母草碱的致畸性进行评价;同时采用Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验这3个标准试验组合的方法,分别从体外到体内,从微生物、离体真核细胞到整体动物水平系统检测其致突变性[8-9],旨在为临床安全用药提供参考。
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按《药物生殖毒性研究技术指导原则》[10-11]的要求,将雌鼠与雄鼠1:1合笼,交配第2天起对雌鼠进行阴道涂片检查,若显微镜下查见精子则视为交配成功,成功当天即为妊娠GD0。然后将这部分雌鼠按体重随机分为4组,每组20只。急性毒性试验结果提示SD大鼠经口灌胃给予益母草碱,最大耐受量(MTD)>5 000 mg/kg,因此,本试验设高、中、低剂量组(2 000、1 000和500 mg/kg体重),另设溶媒对照组,分别对不同组别的雌鼠连续灌胃给药10 d(给药起止时间为GD6~GD15)。于GD0、GD5、GD6~GD15和GD20 时称取孕鼠的体重。在GD20时处死孕鼠,观察外观是否异常,同时记录其活胎数(区分雌雄)、黄体数、着床数、死胎数等。所有的胎鼠,取其中约一半数量固定于Bouin液中作内脏检查,另一半固定于75%乙醇中制作骨骼标本,用于骨骼畸形检查。
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按《药物遗传毒性研究技术指导原则》[12-13]的要求,分别应用反映基因突变的Ames试验[14]、反映染色体畸变的染色体畸变试验(体外培养CHO细胞)[15]和小鼠微核试验(体内)[16]方法。
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应用TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535这5支菌株,设5个剂量组(5 000、500、50、5、0.5 μg/皿),此外还设空白对照、溶媒对照和阳性对照组,每个剂量组及对照组均设3个平行皿(具体剂量见表1)。采用标准平板掺入法,使细菌在有或无代谢活化系统S9的条件下接触受试物,并用最低极限的琼脂培养基培养48~72 h后,先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况,确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用,再人工计数每皿回复突变的菌落数,记录原始数据,并计算每组的均值和标准差,与溶媒对照组进行比较[8, 17-18]。重复试验一次。
菌株 无代谢活化系统(−S9) 有代谢活化系统(+S9) 阳性对照品名称 加入量
(μl/皿)配制浓度
(µg/ml)终浓度
(µg/皿)阳性对照品名称 加入量
(µl/皿)配制浓度
(µg/ml)终浓度
(µg/皿)TA97 敌克松 100 500.0 50.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA98 敌克松 100 500.0 50.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA100 甲基磺酸甲酯 100 10.0 1.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA102 甲基磺酸甲酯 100 10.0 1.0 1,8-二羟基蒽醌 100 500.0 50.0 TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物 100 5.0 0.5 环磷酰胺 100 500.0 50.0 -
在有或无代谢活化系统S9的条件下,在体外培养的CHO细胞中加入对应的不同浓度的受试物或对照品,反应体系总体积为10 ml。高、中、低剂量组受试物终浓度依次为1000、500和250 μg/ml,阳性对照组丝裂霉素C和环磷酰胺的终浓度分别为0.5、60 μg/ml,另设溶媒对照组分别作用于细胞4 h后换液,继续培养至24 h,最后收集细胞。用秋水仙碱处理所有细胞,将细胞终止在有丝分裂中期,经0.75%氯化钾低渗、1∶3醋酸甲醇固定、滴片和Giemsa染色后,在显微镜下计数和观察染色体的数量或结构是否改变[8, 17-18]。
观察对象的选择为染色体分散良好、数目完整的中期分裂相细胞,采用盲法读片,受试物及溶媒对照组每组观察200个细胞,阳性对照组观察100个细胞,计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目[8, 17-18](裂隙和核内复制一般不作为畸变类型),计算畸变率。
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受试物采用经口灌胃的方式(与临床给药途径一致)给药,急性毒性试验结果提示ICR小鼠经口灌胃给予益母草碱,MTD>5 000 mg/kg,故高、中、低剂量分别设为2 000、1 000和500 mg/kg体重,同时设溶媒对照及阳性对照组。给药容积为10 ml/kg体重。以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射给予环磷酰胺(阳性对照),给药容量为10 ml/kg体重。溶媒对照组以10 ml/kg体重的容积经口灌胃给予0.5% CMC-Na溶液。小鼠在给药24 h后处死,每只动物取其两侧股骨骨髓,制2张涂片,用甲醇固定,然后用pH6.8的Giemsa染液进行染色。
每只小鼠镜检1 000个骨髓嗜多染红细胞(PCE),计数含微核的PCE数(MNPCE),计算微核发生率,同时记录200个PCE计数过程中观察到的正染红细胞(NCE)的数目,并计算PCE/NCE值,以评价受试物是否有骨髓毒性[8, 17-18]。
2.1. 胚胎-胎鼠发育毒性试验
2.2. 遗传毒性试验
2.2.1. Ames试验
2.2.2. 染色体畸变试验
2.2.3. 骨髓微核试验
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益母草碱各受试剂量作用下在给药期间(GD6~GD15)、停药后(GD15~GD20)以及整个孕期(GD0~GD20)孕鼠的增重与对照组相比,差异均无统计学意义;各受试剂量组子宫连胎重量、子宫重量、黄体数、着床率、每窝平均活胎数、死胎数和吸收胎数、活胎率、死胎发生率、吸收胎发生率与对照组相比,差异均无统计学意义;此外,各组胎鼠均未观察到内脏和外观畸形的发生。以上研究结果提示,益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性和致畸作用。
由表2可见,受试物各剂量组胎鼠的体重、身长、胎盘重量及性别比例与溶媒对照组相比无明显差异,提示益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的胎儿毒性。
观察指标 溶媒对照组 益母草碱组(mg/kg体重) 500 1000 2 000 受检胎鼠数(只) 184 174 160 168 性别比例(雄:雌) 93∶91 81∶93 80∶80 88∶80 活胎体重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g) 3.28±0.40 3.25±0.40 3.30±0.40 3.31±0.46 胎盘重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g) 0.56±0.08 0.55±0.09 0.56±0.08 0.55±0.09 活胎身长($ \bar x \pm {\rm{s}}$, cm) 3.60±0.18 3.57±0.20 3.57±0.21 3.61±0.22 由表3~5可见,受试物各剂量组胎鼠观察指标的数目及发育程度与溶媒对照组相比无明显差异,提示益母草碱在各受试剂量下对胎鼠骨骼的发育未见明显影响。
观察指标 溶媒对照组 益母草碱组(mg/kg体重) 500 1000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 颈椎数 7.0±0.0 7.0±0.0 7.0±0.0 7.0±0.0 胸椎数 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 腰椎数 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 尾椎 2.3±0.6 2.3±0.7 2.4±0.6 2.4±0.6 骶椎数 5.5±0.6 5.5±0.6 5.6±0.6 5.5±0.5 肋骨数 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 胸骨节数 4.7±1.1 4.6±1.1 5.0±1.2 4.7±1.0 掌骨数 7.3±1.0 7.3±1.0 7.5±0.9 7.0±1.0 近端指骨数 0.1±0.4 0.3±1.1 0.2±0.9 0.3±1.0 远端指骨数 9.9±0.4 10.0±0.2 9.9±0.4 10.0±0.2 跖骨数 8.0±0.2 8.0±0.2 7.9±0.4 8.0±0.0 近端跖骨数 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 远端跖骨数 10.0±0.3 10.0±0.2 9.9±0.4 10.0±0.0 枕骨分级 溶媒对照组 益母草碱组(mg/kg体重) 500 1 000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 Ⅰ级枕骨数[n (%)] 27(30.7) 25(29.4) 31(40.3) 29(37.2) Ⅱ级枕骨数[n (%)] 60(68.2) 59(69.4) 45(58.4) 49(62.8) Ⅲ级枕骨数[n (%)] 1(1.1) 1(1.2) 1(1.3) 0(0) Ⅳ级枕骨数[n (%)] 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 观察指标 溶媒对照组 益母草碱组(mg/kg体重) 500 1 000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 胸骨节数 4.7±1.1 4.6±1.1 5.0±1.2 4.7±1.0 骨化不全数 0.7±0.8 0.5±0.6 0.7±0.7 0.8±0.7 未骨化数 1.4±1.1 1.4±1.1 1.0±1.2 1.3±1.0 -
受试物各剂量组和对照组的平皿通过肉眼观察均未见污染,并且在显微镜下可见背景菌苔生长。试验结果见表6、表7,5个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史对照范围内,并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落数与空白对照组相比显著增加,提示本试验系统符合试验要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下,未观察到受试物的抑菌现象[8, 17-19]。各剂量组受试物在有或无代谢活化系统S9的条件下,对5支菌株所诱发的回复突变菌落数均与溶媒对照组的突变菌落数相近,并且未观察到明显的剂量-反应关系(表8)。
组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 5 000 84±5 70±3 50±3 53±7 86±8 74±3 203±42 193±62 11±4 12±5 500 85±10 79±8 32±9 44±5 91±18 77±13 213±80 174±11 9±3 8±2 50 76±8 71±6 37±5 40±10 72±3 82±15 196±24 184±13 9±1 9±3 5 92±12 81±1 33±4 34±7 87±18 69±13 218±50 176±8 9±2 9±2 0.5 86±25 71±8 37±6 38±9 82±8 80±9 176±48 159±16 10±4 8±2 空白对照组 77±5 75±6 35±12 42±11 90±14 77±13 207±50 194±25 12±7 10±3 溶媒对照组 75±13 77±6 40±14 52±4 90±9 88±11 178±62 172±40 13±3 13±1 阳性对照组 745±49 1 067±176 467±115 711±87 578±61 486±34 636±41 634±32 467±82 433±15 组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 5 000 83±7 80±9 32±4 33±8 94±16 93±7 211±13 196±18 9±2 9±6 500 79±11 79±10 26±4 30±6 78±5 79±7 208±6 195±7 9±1 10±3 50 74±13 74±11 32±4 31±3 95±27 86±8 187±9 195±42 8±2 11±2 5 86±6 79±16 31±4 35±5 83±10 85±14 179±4 177±62 9±1 7±2 0.5 84±9 85±7 26±6 27±2 110±20 91±11 190±1 186±18 8±2 12±5 空白对照组 76±5 80±14 32±6 30±11 88±2 102±10 212±6 176±46 10±2 8±1 溶媒对照组 83±3 79±12 29±3 37±11 84±2 89±9 192±15 184±33 8±2 10±2 阳性对照组 807±5 806±90 934±64 851±163 446±40 496±21 623±23 621±37 480±35 476±53 组别(μg/ml) 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着
丝粒三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 250 +S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 −S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 500 +S9 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 −S9 200 8 0 0 0 0 0 0 0 3 1.5 1 000 +S9 200 5 0 1 0 0 0 0 0 3 1.5 −S9 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 溶媒对照组 +S9 200 2 0 1 0 0 0 0 0 3 1.5 溶媒对照组 −S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 阳性对照组 +S9 100 20 0 0 2 0 0 0 0 17 17* 阳性对照组 −S9 100 18 3 0 0 1 0 0 0 18 18* *P<0.05,与溶媒对照组比较。 -
阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高,24 h在有或无代谢活化系统S9的情况下,染色体畸变率分别为17%和18%,均>10%,为阳性结果;溶媒对照品以及250、500和1 000 μg/ml受试物在24 h、有S9组的染色体畸变率分别为1.5%、1.0%、0.5%和1.5%;24 h、无S9组的染色体畸变率分别为1.0%、1.0%、1.5%和0.5%,综上,溶媒对照组及受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%,为阴性结果[8, 17-18]。
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各剂量组小鼠在给药后均未见异常。微核试验阅片结果见表9。益母草碱在各受试剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用,溶媒对照组雌性和雄性小鼠骨髓的PCE微核发生率分别为4.09‰和2.94‰,阳性对照组雌性和雄性小鼠骨髓PCE微核发生率分别为15.93‰和16.28‰,与溶媒对照组相比,差异均有统计学意义,受试物在500、1 000、2 000 mg/kg剂量下对雌性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为2.53‰、2.16‰和2.17‰,对雄性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为0.78‰、0.79‰和2.96‰,由上述结果可见,受试物各剂量组均未诱发ICR小鼠骨髓PCE微核率的明显增高[8, 17-18, 20]。
组别(mg/kg体重) 性别 动物数(只) 观察PCE数(个) PCE/NCE($\bar x $±s) 微核率($\bar x $±s,‰) 500 雌 5 5 126 1.17±0.17 2.53±1.48 雄 5 5 109 1.14±0.24 0.78±0.81* 1 000 雌 5 5 076 1.19±0.21 2.16±1.28 雄 5 5 093 1.42±0.14 0.79±1.30* 2 000 雌 5 5 117 1.15±0.11 2.17±1.47 雄 5 5 088 1.15±0.20 2.96±2.43 溶媒对照组 雌 5 5 131 1.07±0.03 4.09±1.88 雄 5 5 109 1.15±0.11 2.94±0.98 阳性对照组 雌 5 5 019 1.25±0.09 15.93±7.50* 雄 5 5 039 1.27±0.16 16.28±3.80* *P<0.05,与溶媒对照组比较。