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市售复方酮康唑乳膏包含酮康唑、硫酸新霉素和丙酸氯倍他索,是治疗浅部真菌感染的常用药物。其中,酮康唑是最常用的抗真菌药物,具有价格低、抗菌谱广、抗真菌活性强等优势。但细菌对硫酸新霉素易产生耐药性,可导致患者反复感染,难以根治,且丙酸氯倍他索不适合12岁以下儿童使用,副作用较多,可产生红斑、灼热、瘙痒等刺激症状,长期大面积用药可导致高血糖等[1-5]。针对上述问题,为改善市售产品的有效性和安全性,本课题组将硫酸新霉素替换为抗菌作用更强的莫匹罗星,将丙酸氯倍他索替换为副作用较少的糠酸莫米松,再结合酮康唑,制备新型复方酮康唑软膏,以提高患者的用药依从性[6-8]。
本研究采用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松3种药效成分的含量,该方法目前未见有文献报道。本法简便,灵敏,分离度好,准确性高,可以为该制剂的质量标准研究提供依据。
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分别取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松适量,精密称定,加流动相制备成适宜浓度的溶液,以相应的溶剂为空白溶液,在190~400 nm波长范围内进行紫外扫描,结果见图1。
由图1可见,莫匹罗星在220 nm处具有最大吸收波长,糠酸莫米松在248 nm处具有最大吸收波长,酮康唑在203 nm和245.5 nm具有最大吸收波长,三者在220 nm与248 nm之间均有吸收,因在供试品中酮康唑和莫匹罗星的浓度均是糠酸莫米松的20倍,糠酸莫米松在220 nm处响应值较小,为保证3种药物能同时测定,确定酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的检测波长为248 nm。
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色谱柱:Intersil ODS-3柱(250 mm×4.6 mm,5 µm),流动相为甲醇-pH5.5磷酸盐缓冲液(65∶35),柱温45 ℃,流速1.0 ml/min,检测波长248 nm,进样量10 µl。理论塔板数以各组分峰计,均不低于5000,各色谱峰的分离度良好。
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酮康唑对照品溶液:取酮康唑20 mg,精密称定,置10 ml量瓶中,加入适量65%甲醇,超声使其完全溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到酮康唑的标准储备液,4 ℃低温避光保存。精密吸取酮康唑的标准储备液1 ml,置于10 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
莫匹罗星对照品溶液:取莫匹罗星20 mg,精密称定,置10 ml量瓶中,加入适量65%甲醇,超声使其完全溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到莫匹罗星的标准储备液,4 ℃低温避光保存。精密吸取莫匹罗星的标准储备液1 ml,置于10 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
糠酸莫米松对照品溶液:取糠酸莫米松10 mg,精密称定,置100 ml量瓶中,加入适量65%甲醇,超声使其完全溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,得到糠酸莫米松的标准储备液,4 ℃低温避光保存。精密吸取糠酸莫米松的标准储备液1 ml,置于10 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
混合对照品溶液:取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的标准储备液各1 ml,置10 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
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取复方酮康唑软膏0.5 g,精密称定,置于50 ml的容量瓶中,加65%甲醇适量,超声溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
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取空白软膏基质0.5 g,精密称定,置于50 ml的容量瓶中,加65%甲醇适量,超声溶解,加65%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得阴性对照溶液。
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取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,用0.22 μm微孔滤膜过滤,弃去初滤液,续滤液分别按照上述色谱条件进样,记录色谱图及相关参数。莫匹罗星的保留时间为5.075 min,理论塔板数为9196,对称因子0.81;糠酸莫米松的保留时间为18.413 min,理论塔板数为11859,对称因子0.88;酮康唑的保留时间为23.318 min,理论塔板数为12291,对称因子0.89,空白基质对莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的测定无干扰,方法专属性好。对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液色谱见图2。
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分别精密吸取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松标准储备液各0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2 ml,置10 ml量瓶中,用65%甲醇稀释至刻度,摇匀,0.22 μm微孔滤膜过滤,弃去初滤液,续滤液按上述色谱条件分别进样10 µl,记录色谱图峰面积。以峰面积A对浓度C (µg/ml)进行线性回归,结果见表1。
药名 线性方程 r 线性范围(µg/ml) 莫匹罗星 A=2.295C+10.20 0.9995 40.0~400.0 糠酸莫米松 A=28.240C+1.871 0.9995 2.0~20.0 酮康唑 A=12.280C+27.94 0.9995 40.0~400.0 -
分别精密量取同一批复方酮康唑软膏6份,每份约0.5 g,按“2.3.2”项下操作,测定,计算酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松含量。结果见表2,结果表明该方法重复性良好。
药物 含量(µg/ml) 测得量(µg/ml) 平均含量(µg/ml) RSD(%) 莫匹罗星 200.00 203.60 204.30 1.51 200.00 204.90 200.00 201.70 200.00 208.80 200.00 206.40 200.00 200.40 糠酸莫米松 10.00 10.10 9.99 1.23 10.00 9.91 10.00 10.06 10.00 10.10 10.00 9.99 10.00 9.79 酮康唑 200.00 203.30 203.60 0.65 200.00 203.90 200.00 202.60 200.00 204.90 200.00 205.00 200.00 201.60 -
取供试品溶液,室温放置,分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样10 µl测定,计算不同时间点莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的含量,结果见表3。
主药 时间(t/h) RSD
(%)0 2 4 6 8 12 24 莫匹罗星 100.00 99.94 100.00 99.94 99.81 99.12 98.49 0.68 糠酸莫米松 100.00 99.69 100.49 100.38 100.38 99.65 98.37 0.74 酮康唑 100.00 99.90 100.06 100.02 100.04 99.64 100.00 0.15 -
分别精密称取莫匹罗星8、10、12 mg,糠酸莫米松0.4、0.5、0.6 mg,酮康唑8、10、12 mg(相当于标示量的80%、100%、120%),精密称定,分别置于0.5 g的空白基质中,加适量流动相溶液,超声10 min使溶解,置于50 ml量瓶中,加流动相溶液稀释至刻度,摇匀,得低、中、高不同浓度的溶液,每个浓度各3份。用0.22 µm微孔滤膜过滤,弃去初滤液,续滤液按上述色谱条件分别进样,记录色谱图峰面积。根据回归方程计算出相应浓度和含量,并计算回收率、平均回收率及RSD。结果见表4。
药名 加入量(µg/ml) 测得量(µg/ml) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD
(%)莫匹罗星 160.00 154.40 96.50 97.50 0.59 160.00 156.59 97.87 160.00 155.87 97.42 200.00 195.76 97.88 200.00 193.35 96.67 200.00 194.55 97.28 240.00 235.70 98.21 240.00 234.92 97.88 240.00 234.74 97.81 糠酸莫米松 8.00 7.73 96.62 97.99 0.79 8.00 7.84 98.00 8.00 7.83 97.91 10.00 9.88 98.80 10.00 9.71 97.10 10.00 9.78 97.80 12.00 11.88 99.00 12.00 11.85 98.75 12.00 11.75 97.92 酮康唑 160.00 153.63 96.02 97.62 0.74 160.00 156.39 97.74 160.00 155.84 97.40 200.00 195.72 97.86 200.00 194.06 97.03 200.00 195.44 97.72 240.00 236.46 98.52 240.00 235.60 98.17 240.00 235.38 98.08 -
取3批样品,依法测定,结果见表5。
样品批号 酮康唑 莫匹罗星 糠酸莫米松 20190411 99.03 99.20 101.4 20190415 106.3 99.76 101.6 20190408 100.6 100.7 100.7