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在高原地区,红景天作为一种常见的抗高原缺氧药,对其研究和开发具有重要意义。国内外对20多种红景天进行了化学成分的研究,证明红景天苷是有特殊生理、药理功能的有效单体[1],而红景天苷和苷元酪醇是迄今为止,研究最多的有效成分,且由于红景天中红景天苷的含量较高,常被用来评价红景天属植物药用价值的指标成分[2-6]。红景天临床应用广泛,对冠心病、高血压、心肌损伤、急性脑梗死等心脑血管系统疾病都有着良好的治疗作用。临床研究和现代药理学研究表明,大株红景天的主要化学成分为络醇、苷类等化合物,可通过扩张血管,增加血流量,使得心脏后负荷降低,心绞痛得以治疗;可使得抗缺氧耐受能力增强,耗氧量降低。红景天能够改善心肌细胞中的缺氧诱导因子-1(信使核糖核酸)的表达,从而改善因高原空气稀薄而引起的缺氧症状[7-9]。
目前测定红景天苷常用高效液相色谱法[10-13],但灵敏度较低,分析时间较长,为克服这一缺点,笔者采用LC-MS/MS的分析方法来检测红景天胶囊中红景天苷的含量。
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色谱柱为Shim-pack XR-ODS柱(3.0 mm×75 mm,2.0 μm);流动相为乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(90∶10,V/V);流速:0.40 ml/min;柱温:25 ℃;样品采集量:10 μl;分析时间为3 min。
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采用电喷雾离子源(ESI),负离子模式,离子源参数:雾化温度(TEM):250 ℃;喷雾电压(IS):−3700 V。多反应监测模式(MRM)参数:红景天苷和茶碱定量离子对分别为m/z 299.0→119.0,m/z 178.8→164.0,碰撞诱导解离电压(DP)均为−55 eV;碰撞能量(CE)均为−14 eV。质谱图见图1。
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精密称取红景天苷对照品0.1 mg,置于5 ml容量瓶中,加入5 ml灭菌注射用水至刻度,摇匀,得浓度20 μg/ml红景天苷对照品储备液,4 ℃冰箱储存备用。
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精密称取茶碱对照品0.1 mg,置于5 ml容量瓶中,加入5 ml甲醇,摇匀,配成20 μg/ml茶碱对照品储备液,4 ℃冰箱中储存备用。
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取10粒红景天胶囊,称重,称其重量为4.8076 g。将其去除胶囊壳后,再次称重为3.6022 g。取胶囊内容物20 mg,置于5 ml的棕色瓶中,加入灭菌用水,摇匀,配制成样品溶液,将此浓度的样品作为母液,过滤,放置在4 ℃冰箱中保存用于样品浓度的测定。
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分别精确吸取各浓度红景天苷的对照品溶液或样品溶液,置于5 ml 容量瓶中,加入茶碱对照品溶液,加甲醇稀释至刻度,混匀后,取100 μl置于0.5 ml离心管中,13 000×g高速离心10 min,离心后各吸取50 μl进行分析,进样量为10 μl。
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分别精密量取“2.2.1”项下制备的红景天对照品溶液,按“2.2.4”项下供试品溶液制备方法,配制成10、50、100、250、500、1000、2000ng/ml等6种不同浓度的对照品溶液,茶碱对照品浓度为50 ng/ml。依次进样,记录峰面积。以峰面积求得回归方程:Y=0.00317X−0.0291(r=0.9991)。结果表明,样品中红景天苷在10~2 000 ng/ml范围内线性关系良好。以S/N>10确定,定量下限(LOQ)10 ng/ml。对照品及供试品的色谱图如图2。
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精密量取对照品溶液,按“2.1”项下色谱质谱条件连续进样6次,测定峰面积。红景天苷峰面积RSD为1.9%。仪器精密度良好,符合要求。
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精密称取同一批号样品6份,按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱质谱条件,分别进样,测定红景天苷的峰面积,RSD为2.7%(n=6),结果表明本方法重复性良好。
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按“2.1”项下色谱质谱条件,分别精密量取在室温(10~30 ℃)下放置 0、2.5、5、7.5、10、24 h 的同一份供试品溶液进样测定,记录红景天苷的峰面积,6 次进样结果表明,供试品溶液在 24 h内基本稳定,RSD为2.8%。
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取同一批次(批号:190402)已知含量的红景天胶囊样品9份,分别按相当于样品溶液中红景天苷含量的80%(n=3)、100%(n=3)、120%(n=3)加入“2.2.4”项下制备的供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定。计算回收率,结果回收率在98.7%~103.2%之间,RSD为2.96%~4.21%,符合要求。
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根据建立的红景天苷含量测定方法,3批次红景天胶囊(规格:0.3 g/粒)进行含量测定,结果见表1。
批号 红景天苷浓度(mg/粒) RSD(%) 190402 15.13 1.26 190908 15.29 2.47 180607 13.48 1.77