Isolation and characterization of collagen from the jellyfish Nemopilema nomurai

胶原蛋白主要存在于动物皮肤、骨骼和结缔组织中，是主要的结构蛋白质。胶原蛋白具有较低的免疫原性、较好的生物相容性、良好的生物降解性等生物学优点，广泛应用于生物制药、医疗保健、组织工程、食品加工、美容化妆品等领域。目前胶原蛋白主要来源于陆生牲畜（牛、羊和猪等），但某些疾病（口蹄疫、疯牛病）以及宗教相关问题，使得这些牲畜来源的胶原蛋白应用受到一定约束^[1]。海洋来源的胶原蛋白资源丰富，且不存在传染性病菌和伦理等问题，因而，对海洋生物来源的胶原蛋白进行开发利用具有良好的应用前景^[2]。

目前，从海洋生物提取胶原蛋白的研究主要集中在鳕鱼、罗非鱼、海参以及水母等，这些海洋生物的皮肤、肌肉、软骨组织及中胶层等部位中含有丰富的胶原蛋白^[3]。水母是一类胶质状的浮游生物，属刺胞动物门，种类多，分布广，我国近海海域水母资源丰富。大型水母伞部直径可达2 m，中胶层非常厚实，其中胶原蛋白（122.64～693.92 mg/g，干重）约占总蛋白含量的50%^[4]。本研究选用青岛海域采集的越前水母（Nemopilema nomurai），对其伞部胶原蛋白进行分离纯化和表征，为水母胶原蛋白的开发应用提供理论基础。

SCIENTZ-12N冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LA8080氨基酸自动分析仪（日本株式会社日立高新技术科学）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Scientific公司）；X′Pert3 Powder X射线衍射仪（荷兰帕纳科公司）；VARIOSKAN LUX多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；Mini-PROTEAN Tetra System垂直电泳系统（美国BIO-RAD公司）。

越前水母样品采集于青岛海域，腌制后于−20 ℃保存；牛I型胶原蛋白标准品（河北考力森公司）；胃蛋白酶（上海生工生物工程公司）；标准蛋白Marker（日本TaKaRa公司）；其余试剂均为国产分析纯。

提取：经腌制的水母样品用自来水清洗，去除表面盐分，4 ℃下用去离子水浸泡、洗净后，再用异丙醇去除脂肪、NaOH去除杂蛋白、过氧化氢去除色素。称取去杂水母伞盖样品，组织匀浆后加入相应体积不同浓度（0.3～0.6 mol/L）的乙酸溶液，胃蛋白酶的添加量为水母伞盖质量的0.1%～0.5%，酶消化时间为24～96 h，反应后的液体使用200目网过滤，离心（4 ℃，10000 r/min）30 min取上清即得粗提液。

纯化：①超滤：分别取粗提液5 ml至分子量10万和5万的超滤管中，4 ℃离心（4000 r/min，30 min），收集滤液进行SDS-PAGE分析。②透析：分别取粗提液5 ml到分子量5万和10万的透析袋中，4 ℃透析3 d，每8 h换一次透析液，取样进行电泳分析。③盐析：取粗提液5 ml，添加NaCl至浓度为0.9 mol/L，4 ℃下10000 r/min离心10 min，收集沉淀，复溶于0.5 mol/L乙酸溶液，重复上述过程2次，取溶液进行电泳分析。仅改变NaCl浓度（0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L或2.0 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L），重复实验。

粗提液纯化后，在−80 ℃冷冻干燥得水母酶溶性胶原蛋白（PSC）。

以水母胶原蛋白得率（冻干胶原蛋白质量/水母干重）为指标，确定基本反应条件（乙酸浓度、料液比、胃蛋白酶用量、提取时间），每次改变其中一个条件进行水母胶原蛋白提取的单因素实验。

获得单因素数据后，设计正交实验（表1）来获取最佳的实验方案。

参照Coentro等^[5]的方法检测胶原蛋白浓度，将100 μl胶原蛋白溶液添加至1 ml天狼星红色染料中静置30 min，然后以12000 r/min离心30 min。去除上清，沉淀用碱性试剂溶解30 min，取200 μl胶原蛋白液于540 nm处读数。

用X射线衍射仪分析胶原蛋白样品的晶体结构，X射线源为Cu靶Ka辐射（λ=0.154 nm），电流为40 mA，电压为40 kV。扫描角度2θ为5°～40°，扫描速率为3.6°/min，并根据公式λ=2d sinθ，计算d值。

胶原蛋白溶解于0.5 mol/L乙酸中，用多功能酶标仪检测其紫外光谱。扫描波段为200～400 nm，波长间隔为1 nm。以0.5 mol/L乙酸溶液作为空白对照。

取胶原蛋白5 mg和适量KBr置于研钵中，研磨均匀。取适量的混合样品于压片磨具中，用压片机制成试样薄片。将压片放入傅里叶变换红外光谱仪内进行扫描（500～4000 cm⁻¹，分辨率2 cm⁻¹）。

胶原蛋白溶液和上样缓冲液混匀后水浴（100 ℃）加热5 min，取15 μl上样，使用8%的分离胶和5%的浓缩胶，80 V电泳100 min。

胶原蛋白样品在110 ℃下盐酸水解24 h，水解产物12000 r/min离心20 min，上清液用氨基酸自动分析仪进行氨基酸含量测定。

将胶原蛋白样品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，配成1 mg/ml的胶原蛋白溶液，分别取10 ml溶液调配成不同pH值（3～9共7个梯度）和NaCl浓度（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mol/L），10000 r/min离心，取上清液进行胶原蛋白浓度测定，并绘制变化曲线。

数据采用（$\bar x $±s）表示，用 GraphPad Prism 8.0.2作图并对各组进行方差分析，两组间比较采用t检验。检验水准α=0.05，P<0.05有统计学意义。

从图1A可见，当酶的用量从0.1%升到0.3%时，胶原蛋白得率逐渐增高并达到最大值。继续增加酶使用量，胶原蛋白得率反而减少，可能是过量酶对胶原蛋白具有一定破坏作用。从图1B可见，当乙酸浓度为0.4 mol/L时，胶原蛋白的得率最高。而乙酸过量，会破坏已生成胶原蛋白。从图1C可见，料液比在1∶2 g/ml时，水母胶原蛋白的得率最大。可能是料液比低于1∶2 g/ml时，胶原溶胀不充分，而料液比继续增加并没有多余胶原以供溶胀。从图1D可见，随着时间推移，胶原蛋白的得率先升高再下降：48 h和24 h相比，增加了8.8%；72 h和48 h相比，增加了15.9%；96 h和72 h相比，得率反而下降，说明72 h是胶原蛋白提取的最佳时间点。

表2正交实验极差R分析中，R_A>R_D>R_C>R_B，即在胶原蛋白提取中，酶的使用量起着最关键的作用，提取时间排第二，料液比和乙酸浓度的影响比较小。综合这9组数据，确定最优理论水平为A₃B₂C₂D₃，即乙酸（0.4 mol/L）、料液比（1∶2 g/ml）、胃蛋白酶（0.3%），提取72 h，此时的得率为（33±0.63）%。

图2中水母胶原蛋白粗提物（泳道8）在分子量13万处含有大量的目标胶原蛋白，分子量10万以下有杂条带。不同规格透析袋处理（泳道1、2）后，分子量10万以下的杂蛋白部分去除；盐析结果显示，0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L NaCl的盐析（泳道4）可以去除大量杂蛋白，但目标蛋白损失较多，而0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl（泳道3）处理既可以保留目标蛋白又能够去除部分杂蛋白。最后超滤结果显示，分子量10万（泳道6）的超滤管可以明显减少杂蛋白含量。

纯化实验结果提示，单一纯化方法不能完全去除杂蛋白，传统透析处理耗时长，而反复盐析会增加胶原蛋白溶液NaCl含量。综合权衡后确定纯化条件为0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl盐析和100 kDa超滤组合。图3是组合纯化后胶原蛋白电泳图：泳道b为牛I型胶原蛋白标准品，在分子量13万左右有α₁、α₂链，而β链γ链的分子量都在20万以上。本实验提取的水母胶原蛋白（泳道a），分子量10万下基本没有杂蛋白，但α链只发现了一条，其分子可能是(α₁)₃^[6-7]，分子量在13万左右，符合I型胶原蛋白的特征。

胶原蛋白X射线衍射分析结果如图4、表3所示。水母胶原蛋白和牛胶原蛋白都有3个衍射峰。峰1形状尖锐与胶原蛋白三螺旋结构有关，d值反映胶原蛋白分子链间距离^[8]，水母和牛胶原蛋白的d₁值分别为1.244 nm和1.226 nm。在20°附近出现一个宽大峰（峰2），代表胶原蛋白纤维内部众多结构层次所引起的漫散射^[9]。在30°附近出现了第3个峰（峰3），该峰较小，其d值显示三股螺旋结构中沿螺旋中心轴相邻氨基酸残基之间的距离^[10]，水母和牛胶原蛋白峰3的d₃值分别为0.295 nm和0.296 nm，极为接近。说明水母胶原蛋白和牛胶原蛋白标准品一样，保持了完整的三股螺旋结构。

蛋白通常含有芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，这些氨基酸含有苯环共轭双键系统，在特定波长（280 nm和251 nm）处有最大吸收峰。但在胶原蛋白中这些氨基酸含量少，其紫外吸收峰主要集中在220~230 nm，主要是由羰基C=O的n→π跃迁所致。水母胶原蛋白的紫外光谱如图5所示，其最强吸收峰在220 nm处，与牛胶原蛋白吸收峰出现的位置类似，接近Ab Aziz等^[11]报道的水母Rhopilema hispidum胶原蛋白紫外吸收峰（218 nm），提示本实验中提取的水母胶原蛋白纯度较高。

从图6可见，水母胶原蛋白酰胺A吸收峰为3288 cm⁻¹，和Rastian等^[12]检测的酰胺A（3292 cm⁻¹）吸收峰接近，表明氢键存在于胶原蛋白结构中。胶原蛋白分子中CH₂基团的不对称伸缩振动产生了酰胺B特征吸收峰^[13-14]，水母胶原蛋白的酰胺B在2933 cm⁻¹处，和牛胶原蛋白的酰胺B（2936 cm⁻¹）吸收峰类似。作为蛋白质二级结构变化的特征区域——酰胺Ⅰ带（1625～1690 cm⁻¹），是由蛋白质肽链骨架的C=O伸缩振动产生^[15]，水母胶原蛋白的酰胺I带出现在1641 cm⁻¹。水母胶原蛋白酰胺II带吸收峰出现在1543 cm⁻¹，在胶原蛋白酰胺II带（1500～1600 cm⁻¹）的范围内，可能是C—N键的伸缩振动和N—H弯曲振动产生。水母胶原蛋白酰胺Ш位于1236 cm⁻¹处，主要是脯氨酸侧链和甘氨酸骨架的—CH₂摇摆振动产生，提示所提取的水母胶原蛋白三螺旋结构完整性较好。

电泳图谱表明提取的水母胶原蛋白达到电泳纯（95%）。文献报道^[16-18]天狼星红染料与胶原蛋白中的特征性结构Gly-X-Y结合，可以使用天狼星红染料对胶原蛋白进行快速检测。本实验测得每100 mg冻干的水母胶原蛋白样品中含有胶原蛋白96.85 mg，其纯度为96.85%。

如表4所示，水母胶原蛋白的氨基酸组成中，甘氨酸占34.8%，与云南深水鲷鱼皮胶原蛋白甘氨酸含量（35%）接近，比热带淡水鲤鱼鳞中胶原蛋白甘氨酸含量（30.6%）高^[19]。水母的胶原蛋白中羟脯氨酸占6.3%，脯氨酸占8.2%，亚氨酸比例为14.5%。其脯氨酸羟基化度（羟脯氨酸含量/亚氨酸含量）为43.68%，比牛胶原蛋白标准品的羟基化度（39.92%）和Zhang等^[7]提取的水母胶原蛋白的羟基化度（32.2%）都高。据文献报道^[20]，羟基化度越高，胶原蛋白的三螺旋结构越稳定。检测结果中还发现蛋氨酸、酪氨酸和组氨酸的含量比较低，缺乏色氨酸，这些都符合I型胶原蛋白的特点^[21]。

从图7A可见，当NaCl浓度在0.5～0.8 mol/L时，水母胶原蛋白相对溶解度比较稳定，保持着最大值。其原因可能是低浓度的盐离子可以与胶原蛋白分子结合，使得胶原蛋白分子带有更多的电荷，相互排斥，溶解度较大。当NaCl浓度达到0.9 mol/L时，水母胶原蛋白的溶解度急剧下降，相对溶解度不到23%，当NaCl浓度超过1.0 mol/L后，其相对溶解度在15%左右。可能因为NaCl的浓度较高时，极性较强的盐离子夺走了胶原蛋白结合的水分子，破坏了其周围的水化膜，盐析作用显现出来，溶解度下降。

从图7B可见，当溶液的pH在3～5时，水母胶原蛋白的相对溶解度比较大，维持在80%左右。其中pH为4时，溶解度最大，与海参胶原蛋白的溶解性类似^[3]。当pH在6～8时，胶原蛋白的相对溶解度维持在较低值，尤以pH 7时溶解度最小，此时就是胶原蛋白的等电点。当pH超过8后，胶原蛋白溶液的溶解度又有所上升。

本实验通过单因素分析和正交实验优化了水母胶原蛋白的提取条件，确定最适条件为：乙酸0.4 mol/L、料液比1∶2 g/mL、胃蛋白酶0.3%、反应72 h。水母胶原蛋白的纯化方法优化为0.9 mol/L-0.9 mol/L-0.9 mol/L NaCl盐析和分子量10万超滤的组合方法。相比阳离子交换层析法和Sephacryl S-100凝胶过滤纯化方法，超滤不仅可以去除盐分和杂蛋白，还能快速富集胶原蛋白，缩短提取时间。

纯化的水母胶原蛋白通过天狼星红法检测其纯度为97%，高于从其他多种海洋生物提取的I型胶原蛋白纯度^[22-23]。本实验中越前水母胶原蛋白干重得率为33%左右，相比于水母Chrysaora quinquecirrha胶原蛋白提取得率（1.2%干重）显著提高^[24]。凝胶电泳显示提取的水母胶原蛋白构型可能是(α₁)₃，α₁链分子量约为13万和10万以下基本没有杂条带，比Jankangram等^[25]提取的水母胶原蛋白纯度更高。在氨基酸组成分析中，越前水母胶原蛋白甘氨酸占34.82%，羟脯氨酸占6.33%，脯氨酸占8.16%，没有检测到色氨酸。以上结果均表明水母胶原蛋白符合I型胶原蛋白的特点。光谱分析发现，分离纯化过程中水母胶原蛋白三螺旋结构保存较好。溶解度试验表明其在pH=4时溶解性最佳，当NaCl浓度升高至0.9 mol/L时溶解度快速下降。

总之，本研究通过优化提取纯化过程，缩短了水母胶原蛋白制备时间，提高了所得胶原蛋白的纯度，且水母胶原蛋白三螺旋结构保持完整，与牛I型胶原蛋白特征相似度很高，提示水母胶原蛋白可望成为哺乳动物胶原蛋白的替代品。鉴于水母胶原蛋白具有资源丰富、提取方便、生物相容性好等优点，可望成为生物医药、食品、化妆品等多领域的理想生物材料，具有良好的应用前景。