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积雪草酸,是一种乌苏烷型三萜化合物,是积雪草中的主要药用成分,具有保肝、抗肿瘤、改善认知、降血糖、抗炎、抗菌、护肤等药理作用[1-2]。但是积雪草酸溶解度小,口服生物利用度低,较难通过血脑屏障,使得积雪草酸的使用受到一定限制,已有研究人员对积雪草酸进行了多种化学修饰,获得了一系列不同特性的积雪草酸衍生物[1-5]。由于积雪草酸结构的特殊性,化学修饰位点较少,生物修饰是对天然药物进行结构修饰的重要方法,已有研究报道通过微生物对积雪草酸进行生物修饰[6-8]。本实验通过总状共头霉CGMCC 3.2500对积雪草酸进行结构修饰,采用高分辨质谱(HR-ESI-MS)以及多种核磁共振(NMR)波谱:氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR)、1H-13C异核单量子相干谱(1H-13C HSQC)、1H-13C异核多键相关谱(1H-13C HMBC)、1H-1H 核Overhauser效应谱(1H-1H NOESY)等技术对其结构进行确证,获得了一个新的化合物,为积雪草酸的应用与开发提供参考依据。
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化合物1为白色固体粉末,高分辨质谱显示出[M-H]-分子离子峰m/z 501.3240,结合1H NMR谱和13C NMR谱推断确定分子式为C30H46O6。1H NMR(600 MHz, pyridine-d5)中,高场处有6组甲基氢信号δ 1.47 (3H, s)、δ 1.18 (3H, s)、δ 1.03 (3H, d, 6.6)、δ 0.98 (3H, s)、δ 0.92 (3H, d, 6.0)、δ 0.82 (3H, s);低场处有一活泼氢信号:δ 5.61 (t, 3.6),推测为双键上的氢。13C NMR谱检测结果显示两个不饱和碳原子δ 127.04和δ 140.86,一个羧基碳原子δ 180.36,一个羰基碳原子δ 213.29,综合以上信息可以推断该化合物为乌苏烷型五环三萜酸类化合物。
依据1H-13C HSQC谱(图1)、1H-13C HMBC谱(图2)可以对该化合物的碳氢作进一步的归属。
与底物积雪草酸比较,在13C NMR谱中,213.29 ppm出现一个羰基碳信号,该羰基碳与H-1 (δ 2.58, d, 12.0)、H-3 (δ 5.08, s) 远程相关,说明C-2位的羟基被氧化成羰基。H-3 (δ 5.08, s)和C-3 (δ 78.14)的化学位移未发生显著变化,但是在1H-1H NOESY(图3)中,可以观察到H-3 (δ 5.08, s)和H-24 (δ 0.82)之间的NOE效应,说明3位的羟基构型发生了变化,由β构型转变为α构型。
在13C NMR谱中,68.12 ppm处出现一个连氧碳信号,在1H NMR谱中,4.93 ppm(1H, dd, J=6.6, 9.6 Hz) 出现一个氢原子信号,二者在1H-13C HSQC谱中可观察到相关信号。在1H-13C HMBC谱中,可观察到H-27 (δ 1.47, s)、H-16 (δ 2.45, m)和δ 68.12的相关信号,说明15位发生了羟基化反应。同时H-15ax与H-16ax的耦合常数为9.6 Hz,确定该羟基为α型。
具体的1H NMR 和13C NMR 数据及归属见表1。
位点 C H HMBC 1 54.41 2.58 (d, 12.0); 2.31 (o) 2, 3, 5, 10, 25 2 213.29 / 3 78.14 5.08 (s) 2, 23, 24, 4 4 50.42 / 5 46.73 2.53 (d, 10.8) 4, 10, 7, 25, 24 6 19.48 1.87 (m), 1.97 (m) 7 36.52 2.46 (m); 2.33 (o) 8 42.19 / 9 48.22 2.12 (m) 1, 14, 8, 26 10 44.13 / 11 24.29 1.92 (t, 4.2); 1.96 (m) 8, 9, 13, 12 12 127.04 5.61 (t, 3.6) 14 13 140.86 / 14 49.18 / 15 68.12 4.93 (dd, 9.6, 6.6) 16 36.83 2.45 (m); 2.44 (m) 15, 18, 17, 28 17 47.89 / 18 54.70 2.64 (d, 11.4) 28, 13, 12, 17, 19, 22, 29 19 39.92 1.57 (m) 20 39.71 1.55 (m) 21 31.49 1.44 (m); 1.38 (s) 22 37.55 1.98 (m); 1.99 (m) 17, 20, 21, 28 23 65.38 4.06 (d, 11.4); 3.77 (d, 11.4) 3, 4, 5 24 14.43 0.82 (s) 3, 23, 4, 5 25 18.14 0.98 (s) 1, 5, 10 26 17.91 1.18 (s) 14, 8, 7 27 18.17 1.47 (s) 13, 15, 14, 8 28 180.36 / 29 17.78 1.03 (d, 6.6) 19, 20 30 21.79 0.92 (d, 6.0) 20, 21 综上,化合物1的结构确定为2-氧-3α,15α, 23-三羟基-12-烯-28-油酸(图4)。经文献检索,未发现与该化合物结构相同的报道,确定该化合物为新化合物。