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癌症对人类是仅次于心血管疾病的第二大“杀手”,严重威胁着人类的生命健康[1]。相关统计表明,2018年,全球新增癌症病例1 810万,死亡病例960万[2-3]。预计到2030年,新增癌症病例和死亡人数将增长约1.5倍,其防治形势十分严峻[4]。目前,治疗恶性肿瘤的方法主要有手术切除、放射疗法、生物治疗以及药物治疗等[5]。其中,药物治疗仍是肿瘤治疗的重要手段。但一半以上的癌症对传统化疗药物已产生明显耐药。临床证据显示,90%以上转移性癌症患者死于不同程度的耐药[6],肿瘤耐药已成为目前临床化疗失败的首要原因。因此,开发多药耐药的新型抗肿瘤化疗药物已迫在眉睫。
微管蛋白抑制剂一直是抗肿瘤药物研发的热点之一[7]。微管是由α/β微管蛋白组成的异二聚体,是细胞骨架的主要组成部分[8]。微管具有多种生物学功能,能参与细胞增殖、分裂等一系列过程[9-13],在细胞生命周期中起重要作用,是肿瘤细胞中的重要治疗靶标。紫杉醇、长春碱等微管蛋白抑制剂已广泛用于治疗多种癌症。然而,它们显示出治疗窗窄、选择性差以及多药耐药性问题,通常是由于P糖蛋白[14]或微管相关蛋白的过表达引起的[15]。因此,选择性好的低毒小分子靶向微管蛋白抑制剂仍有很大需求。
查尔酮衍生物是类黄酮中一类重要的化合物,分子结构简单,以1,3-二苯基丙烯酮为基本骨架,具有广泛的生物学活性,如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、抗菌等[16-19]。吲哚查尔酮是本课题组研究发现的一类新型查尔酮衍生物,相比经典的查尔酮,其抗肿瘤活性显著提高,作用机制研究表明该类化合物作用于β微管蛋白上的秋水仙碱位点[20],规避了P糖蛋白调控的肿瘤多药耐药机制[21]以及β-Ⅲ型微管蛋白过表达的影响[22],具有良好的抗肿瘤耐药活性。化合物FC58是本课题组前期合成的查尔酮类衍生物之一,具有非常好的抗肿瘤活性(A549,GI50 = 38 nmol/L)[23]。课题组以此化合物为研究对象,考察其对多种白血病细胞株的生长抑制活性,特别是耐药白血病细胞的活性,并通过细胞周期实验分析其作用特点,现报道如下。
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课题组选择多种白血病细胞及其耐药细胞(HL60、HL60/DOX、K562、K562/HHT300、CCRF-CEM、CCRF-CEM/VLB100)对紫杉醇、长春碱、多比柔星以及查尔酮衍生物FC58进行体外抗肿瘤活性测试。结果如表1所示,紫杉醇、长春碱和多柔比星对HL60、K562、CCRF-CEM细胞均有较强活性,GI50在0.12~135.30 nmol/L。而各耐药细胞对上述3种药物明显耐药,GI50在17.16~1398 nmol/L。耐药指数DRI在3.85~684.4。与紫杉醇、长春碱、多柔比星相比,虽然查尔酮衍生物FC58对以上白血病细胞的活性相对较弱,GI50在30.23~44.20 nmol/L,但对耐药白血病细胞具有优异活性,GI50在17.56~51.77 nmol/L,较亲代细胞更为敏感(图2)。DRI分别是0.40、0.90、1.71。其中,CCRF-CEM/VLB100细胞对FC58仅轻微耐药(DRI=1.71),远低于其他几种化疗药。
细胞系 化合物 紫杉醇 长春碱 多比柔星 FC58 HL60 6.68 2.90 40.27 44.20 HL60/DOX 292.50 89.52 1398 17.56 耐药指数 43.79 30.87 34.72 0.40 K562 12.15 0.12 135.30 31.72 K562/HHT300 98.31 17.16 521.40 28.65 耐药指数 8.09 143 3.85 0.90 CCRF-CEM <1 <1 − 30.23 CCRF-CEM/VLB100 159.3 684.4 − 51.77 耐药指数 >159.3 >684.4 − 1.71 注:“−”表示未检测。 -
微管蛋白抑制剂可干扰微管蛋白-微管之间的平衡,阻断有丝分裂M期纺锤体的形成,导致有丝分裂停滞于G2/M期,从而诱导细胞凋亡[25]。利用流式细胞技术检测FC58、多柔比星、紫杉醇和长春碱对HL60和HL60/DOX细胞周期的影响,考察其作用机制。
如图3所示,与空白组相比,经1.3倍IC50 FC58处理的组,停滞在G2/M期的细胞明显增多。其作用强于紫杉醇,弱于长春碱。经多柔比星处理的组,停滞在S期和G2/M期的细胞较空白组有一定程度的增多。FC58、紫杉醇和长春碱的耐药细胞组的结果与非耐药细胞组结果基本相同。经FC58处理的组,停滞在G2/M期的细胞明显增多,且作用强于其余药物。多柔比星使细胞周期停滞在S期的耐药细胞明显增多。上述结果提示,FC58的作用靶点为微管蛋白。同时,FC58对细胞周期的影响结果与长春碱较相似,间接证明了FC58和长春碱作用机制相似。这可能是FC58对CCRF-CEM/VLB100细胞轻微耐药的原因。