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新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎，COVID-19），具有较强的人际传播能力，传播速度快[1-3]。COVID-19患者会出现与流感类似的症状，包括发烧、咳嗽、乏力、腹泻等，重症患者出现呼吸困难或低氧血症，可发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、多器官功能衰竭等导致死亡[4]。中医药早期干预可有效预防病情向重、危重方向恶化[5]。目前，中医药控制COVID-19的疗效普遍受到重视[6]，业界提倡结合不同疾病阶段使用不同的处方[2]。寒湿郁肺汤为武汉火神山医院依据国家卫健委印发的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》所引进的四种肺炎诊疗中药汤剂处方之一，用于新型冠状病毒初期治疗，该汤剂由苍术、陈皮、厚朴、藿香、草果、生麻黄、羌活、生姜共八味中药组方而成。
UHPLC-MS/MS因具有分离能力强，检测限低，高灵敏度，高选择性等特点，易于开发为临床检测项目的参考方法[7]。本研究应用UHPLC-MS/MS法，依照2015版中国药典对寒湿郁肺汤中11种主成分进行含量测定，为后续的质量研究奠定基础。
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Agilent1290超高效液相色谱仪（包括G4220A二元高压泵、G4226A自动进样器、G1330B控温箱、G1316C柱温箱）、Agilent G6460A型三重四极杆串联质谱仪、电喷雾离子源、Mass Hunter化学工作站B.06.00（美国Agilent公司）；BSA124S-CW型天平、CPA225D型天平（德国Sartorius公司）；Mini spin型离心机、移液枪（德国Eppendorf公司）；Labnet VX-200型定时可调速涡旋混合器（美国Labnet公司）；SK7200H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；UNIVERSAL32R型台式冷冻离心机（德国Hettich公司）。
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香草酸（批号：H11J9Z65318）、厚朴酚（批号：Y27J10C91584）、和厚朴酚（批号：T28O6B5149）、汉黄芩素（批号：T11J11R108209）、刺槐素（批号：C12O8Q45551）、6-姜酚（批号：P29O10F101611）、桔皮素（批号：H24F11K108893）、羌活醇（批号：R28M9F57295）、川陈皮素（批号：N10J10R90249）、紫花前胡苷（批号：W07A10Z94862）、利血平（批号：Y02M11Y17235）、橙皮苷（批号：P06D9F77001）均为对照品，纯度均≥97%，购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇（批号：10951907818，质谱级）、乙腈（批号：JA075930，质谱级）购自德国默克公司；甲酸（批号：17033D，分析纯）、乙酸铵（批号：H1709024，色谱纯）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；水为屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司），其余试剂均为分析纯。
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寒湿郁肺汤中苍术（批号：20092108）、陈皮（批号：20010181）、厚朴（批号：20061903）、藿香（批号：20031708）、草果（批号：19092902）、生麻黄（批号：20200301）、羌活（批号：20070709）等中药材均由上海长征医院药材科提供，生姜（批号：19062404）购于广西壮族自治区。
1.1. 仪器
1.2. 试剂和药品
1.3. 样品
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分别取各对照品适量，精密称定，用甲醇配制成含1.01 mg/ml香草酸、0.99 mg/ml厚朴酚、1.03 mg/ml和厚朴酚、1.00 mg/ml汉黄芩素、1.00 mg/ml刺槐素、1.01 mg/ml 6-姜酚、1.02 mg/ml桔皮素、1.01 mg/ml羌活醇、1.03 mg/ml川陈皮素、1.00 mg/ml紫花前胡苷、1.00 mg/ml利血平（IS）和1.00 mg/ml橙皮苷的对照品溶液，于−20 ℃冰箱保存，备用。
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取寒湿郁肺汤中苍术15 g、陈皮10 g、厚朴10 g、藿香10 g、草果6 g、生麻黄6 g、羌活10 g、生姜10 g，精密称定，置锅中，加水500 ml，浸泡30 min，加热至煮沸后调至文火煎20 min，取药液；第二次加水300 ml，加热至煮沸后调至文火煎20 min，取药液，与第一次药液混匀，取出，放冷。精密量取药液1 ml，加入1 μg/ml的利血平10 μl，涡旋3 min，14 500 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液。
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Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱( 3.5 μm，2.1 mm×150 mm )，流动相为0.2%甲酸水−10 mmol/L醋酸铵溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～0.6 min, 80%～40% A; 0.6～1 min, 40%～30% A; 1～4.3 min, 30%～5% A；流速：0.3 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μl，每个样品的分析周期为4.3 min。
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采用电喷雾离子源（ESI）和多反应监测模式（MRM）。正负离子同时扫描；氮气作为雾化气和干燥气；高纯氮气为碰撞气，毛细管电压为4 000 V；碰撞气压为40 psi；鞘流气温为350 ℃，干燥气温为325 ℃，干燥气流速为12 L/min；将一定浓度的标准溶液和内标溶液进样，在ESI电离方式下进行产物离子全扫描分析（见图1），定量分析质荷比详见表1。
测定成分 母离子
（m/z）子离子
（m/z）裂解电压
(V)碰撞能量
(V)ESI
模式香草酸 167.1 152.3 70 10 − 厚朴酚 265.1 247 148 29 − 和厚朴酚 265.2 223.4 135 29 − 汉黄芩素 283.1 268.1 105 13 − 刺槐素 284.9 241.9 140 34 − 6-姜酚 293.2 293.2 130 0 − 桔皮素 373.1 343.2 135 28 + 羌活醇 377.3 377.3 130 0 + 川陈皮素 403.3 373.3 130 26 + 紫花前胡苷 409.2 247.2 95 11 + 利血平（IS） 609.2 195 240 35 − 橙皮苷 609.2 300.9 135 15 − -
分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各10 μl，按“2.1.2”项下方法制样，再按照“2.2”项下色谱与质谱条件进样测定，记录图谱。结果显示，专属性符合相关要求（图2）。
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精密量取对照品溶液适量，浓度稀释为如下的混合对照品溶液：香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、桔皮素、羌活醇、紫花前胡苷的线性浓度为20、50、100、200、500、1 000、1 500、2 000 ng/ml；6-姜酚、川陈皮素、橙皮苷的线性浓度为200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、15 000、20 000 ng/ml。采用内标定量法按“2.2”项下色谱与质谱条件进行测定，并记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（C），绘制标准曲线，并进行线性回归，结果见表2。
测定成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 香草酸 Y=9.023C-1.345 0.99 0.02~2.00 厚朴酚 Y=0.023C+0.002 0.99 0.02~2.00 和厚朴酚 Y=0.028C-0.060 0.98 0.02~2.00 汉黄芩素 Y=0.701C+1.802 0.98 0.02~2.00 刺槐素 Y=0.488C+0.205 0.99 0.02~2.00 6-姜酚 Y=0.003C+1.510 0.99 0.20~20.00 桔皮素 Y=4.291C+70.573 0.99 0.02~2.00 羌活醇 Y=0.173C+3.849 0.98 0.02~2.00 川陈皮素 Y=0.576C+277.012 0.99 0.20~20.00 紫花前胡苷 Y=0.362C-0.081 0.99 0.02~2.00 橙皮苷 Y=0.011C+0.061 0.99 0.20~20.00 -
将母液稀释10倍，按“2.2”项下色谱与质谱条件进行测定，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果显示，香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11种成分的峰面积RSD分别为1.83%、5.57%、4.39%、3.14%、4.25%、4.01%、1.26%、1.40%、1.75%、3.29%、2.55%，表明该方法精密度良好。
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取同一份寒湿郁肺汤供试品溶液，按“2.1.2”项下方法平行制备6份，按“2.2”项下色谱与质谱条件进行测定，记录峰面积，计算RSD。结果显示，香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11种化学成分的峰面积RSD分别为4.78%、8.40%、5.55%、3.27%、1.51%、3.30%、1.30%、3.37%、1.21%、1.98%、2.46%，表明该方法重复性良好。
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取同一份供试品溶液，按“2.1.2”项下方法制备，室温放置，按“2.2”项下色谱与质谱条件，分别于0、2、4、6、12、16、24 h进样测定，记录峰面积，计算RSD。结果显示，香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷11种化学成分在4 h内的峰面积RSD分别为5.81%、4.68%、3.17%、13.09%、13.20%、8.99%、6.19%、5.19%、4.18%、5.55%、9.47%，表明供试品溶液在室温放置4 h内稳定性良好。
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精密称取已知含量的寒湿郁肺汤样品，加入各对照品适量，平行制备6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱与质谱条件进样测定，进行UHPLC-MS/MS分析，计算各待测物的平均回收率及其RSD。11种待测物：香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷的平均加样回收率分别为111.73%、102.96%、108.94%、102.90%、99.36%、104.83%、100.55%、100.27%、105.49%、96.92%、93.11%，RSD分别为2.44%、2.37%、4.44%、1.92%、4.60%、2.57%、1.79%、2.36%、4.99%、3.08%、3.59%，表明该方法的准确度良好。
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取9批寒湿郁肺汤药材，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱与质谱条件进行测定，计算寒湿郁肺汤9批样本中11种成分：香草酸、厚朴酚、和厚朴酚、汉黄芩素、刺槐素、6-姜酚、桔皮素、羌活醇、川陈皮素、紫花前胡苷、橙皮苷的含量，测定结果为香草酸0.07～0.09 μg/ml、厚朴酚0.06～0.07 μg/ml、和厚朴酚0.26～0.57 μg/ml、汉黄芩素0.07～0.09 μg/ml、刺槐素0.27～0.29 μg/ml、6-姜酚0.55～0.58 μg/ml、桔皮素0.31～0.33 μg/ml、羌活醇0.54～0.58 μg/ml、川陈皮素3.78～3.81 μg/ml、紫花前胡苷0.31～0.33 μg/ml、橙皮苷1.58～1.61 μg/ml。
2.1. 溶液的制备
2.1.1. 对照品溶液
2.1.2. 供试品溶液
2.2. 色谱与质谱条件
2.2.1. 色谱条件
2.2.2. 质谱条件
2.3. 方法学考察
2.3.1. 专属性考察
2.3.2. 线性关系的考察
2.3.3. 精密度试验
2.3.4. 重复性试验
2.3.5. 稳定性试验
2.3.6. 加样回收率试验
2.3.7. 样品含量测定
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在预实验中分别考察了Agilent ZORBAX SB C18（3.5 μm，2.1 mm ×100 mm）、Agilent ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1 mm×150 mm）、Waters Xbridge®HILIC（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters Atlantis®T3（3 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent Eclipse XDB-C18（3.5 μm，2.1 mm×150 mm）等色谱柱对11个待测成分含量测定的影响，结果显示，当色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1mm×150 mm）时，11个待测成分及内标的峰形最佳。
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实验中分别考察了水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈、0.15%甲酸水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈、5 mmol/L醋酸铵溶液-乙腈、10 mmol/L醋酸铵水-乙腈、0.2%甲酸-10 mmol/L醋酸铵水溶液-甲醇、0.2%甲酸-10 mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈等流动相对11个成分含量测定的影响，结果显示，此11个待测成分在0.2%甲酸-10 mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈中，采用梯度洗脱，响应与峰形均佳。
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在预实验中分别考察了培美曲塞、利血平、卡马西平三个标准品作为内标时的响应和出峰时间，最终选用了出峰时间居中、响应好、稳定性高的利血平作为内标。本实验中所选取的化学成分以药典为基础，结合文献调研，舍弃挥发油类成分及违禁成分，最终选取了11个能代表药材的化学成分进行研究。
3.1. 色谱柱的选择
3.2. 流动相的优化
3.3. 内标与化学成分的选择
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本研究基于UHPLC-MS/MS同时测定寒湿郁肺汤中11个成分含量的方法，经色谱柱、流动相的优化和全面的方法学考察，成功应用于样品中寒湿郁肺汤11种成分的测定。该法简便可靠，可为寒湿郁肺汤中的成分检测提供一定的方法参考，也为寒湿郁肺汤的质量控制及质量标准研究奠定了基础。
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