-
盆腔炎是一种常发病于年轻女性上生殖道感染的妇科疾病。临床研究发现,盆腔炎患者上生殖道内存在大量激活的巨噬细胞[1]。在炎症和病原体的刺激下,巨噬细胞过度激活可以释放出大量炎症因子,包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)。研究发现,NLRP3炎性小体激活可以促使caspase-1活化并切割IL-18、IL-1β前体,促进IL-18、IL-1β的成熟与释放,而抑制NLRP3炎性小体过度激活以减轻盆腔炎临床症状,并且与降低炎症因子、趋化因子释放有关。巨噬细胞在不同刺激下可以活化为不同表型:经典活化的M1型和替代活化的M2型。在含有脂多糖(LPS)和IFN-γ微环境中,巨噬细胞活化为变形虫样的M1型,参与炎症的发生。巨噬细胞在含有IL-4、IL-10、IL-13等抗炎因子微环境中被活化为M2型,表达精氨酸酶 1(Arg-1)和甘露糖受体1(CD206) 等特异性标志分子,参与炎症消退和组织重塑。研究发现,M1 /M2比例失衡是多种炎症性疾病的病理标志,如肥胖[2]、糖尿病[3]、动脉粥样硬化[4]等。
益母草碱(LEO)是一种具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用的天然黄酮类化合物[5],研究报道显示益母草碱可抑制Bax/Bcl-2信号通路激活抑制炎症因子的表达[6]。但鲜有益母草碱对巨噬细胞中NLRP3炎症小体影响的报道。本实验以益母草碱为研究对象,探讨其对巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活的影响,以及对巨噬细胞M1/M2表型的调节作用。
HTML
-
益母草碱(纯度>98%,西格玛奥德里奇贸易有限公司,上海);脂多糖(L6143)、DMEM高糖培养基、胎牛血清、NuPAGE 10% Bis-Tris Gel、10×MOPS SDS 运行缓冲液、10×传输缓冲液、预制蛋白Marker、荧光定量PCR、反转录试剂盒(美国赛默飞世尔科技公司);青-链霉素混合液、胰蛋白酶(美国Hyclone公司);Griess试剂盒(江苏碧云天生物试剂公司);IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物公司);PVDF膜(美国Millipore公司);caspase-1兔抗单克隆抗体、β-actin兔抗单克隆抗体、羊抗兔/羊抗鼠单克隆二抗(武汉三鹰生物技术有限公司);NLRP3兔抗单克隆抗体(英国Biorbyt生物试剂公司);四甲基偶氮唑蓝溶液(MTT,美国Bio-Rad公司);TRIzol Regent试剂盒(日本TaKaRa公司)。
-
C57BL/6小鼠,6周龄,雌性,体重(20±2) g,购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠饲养于实验室SPF级动物房,温度(22 ± 1)°C和湿度(60 ± 2)%,动物自由饮食。动物实验操作均通过实验动物伦理委员会批准。
-
以颈椎脱臼的方式处死小鼠,置于75%的乙醇溶液中浸泡10 min,将15 ml PBS缓冲液注入小鼠腹中,仰卧平放,揉捏小鼠腹部5 min,吸出腹液,离心分离巨噬细胞,用DMEM培养液调整细胞浓度,在细胞培养箱中以5%CO2、37 ℃恒温孵育24 h后,换液,去除未贴壁细胞,即得到纯化的小鼠腹腔巨噬细胞[7]。以1.5×105个/ml密度接种于24孔(或96孔)板中培养24 h后,随机分为空白组、益母草碱(10 μmol/L)组、脂多糖(1 μg/ml)组、脂多糖+益母草碱(10 μmol/L)组,益母草碱预处理1 h之后加入脂多糖,放回孵箱中培养,24 h后,提取上清液和细胞蛋白,检测相关指标。
-
脂多糖预处理巨噬细胞24 h后,在96孔板中每孔加入10 μl(5 mg/ml)MTT溶液,于37 ℃孵箱中培养,4 h后取出,移除细胞上清液,每孔加入200 μl二甲基亚砜,放置于恒温摇床震摇10 min,于562 nm处测定OA值,检测相关指标。
-
Griess试剂盒取出,恢复至室温。将细胞上清液和标准品和加入到96孔板中,将试剂I 和试剂II 混匀加入96孔板中,避光,放置于恒温摇床震摇30 min,于470 nm处测定OA值,检测NO含量。
-
提前将ELISA试剂盒取出,恢复至室温。稀释细胞上清液,配置标准品工作液,按照ELISA试剂盒说明书要求依次加入反应液,最后加入终止液,于450 nm处检测OD值,计算IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量。
-
按照Trizol法提取巨噬细胞中总RNA,根据逆转录试剂盒说明书,进行RT-PCR反应。设定反应条件为:5 ℃预变性30 s,接着95 ℃变性6 s,最后60 ℃退火,延伸37 s,重复反应40个循环。RT-PCR引物设计见(表1)。以GAPDH为内参,利用2−∆∆Ct方法分析结果。
基因 引物序列(5′→3′) NLRP3 F: AGAAGAGACCACGGCAGAAG R: CCTTGGACCAGGTTCAGTGT ASC F: TGGATGCTCTGTACGGGAAG R: CCAGGCTGGTGTGAAACTGAA caspase-1 F: CTTGGAAATAGCTCCCAGAA R: CATTTGGGAACTTCTCATCC TNF-α F: CCAATGGCAGAGTGGGTATG R: TGAAGAGGACCTGGGAGTAG iNOS F: GGGAATCTTGGAGCGAGTTG R: GTGAGGGCTTGGCTGAGTGA CD206 F: CAGGTGTGGGCTCAGGTAGT R: TGGTGAGCTGAAAGGTGA Arg-1 F: TTGCTGTGCTCCATAGTTTCCA R: CCATGCAAGTTTCCACTTGT GAPDH F: GGAGAAACCTGCCAAGTATG R: TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG -
脂多糖处理巨噬细胞24 h后,弃去细胞上层培养基,置于冰上,PBS洗涤3次,加入RIPA裂解液(含1%PMSF)反应30 min,离心,收集上清液。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量,配置缓冲液,变性。每孔10 μl加入到10%预制胶中,设置电压200 V电泳30 min,设置电压25 V电转30 min,TBST洗涤,5%脱脂牛奶封闭2 h,TBST洗涤,4 ℃一抗孵育过夜,TBST洗涤,二抗孵育30 min,TBST洗涤,加入曝光剂,曝光。
-
采用SPSS18.0分析实验中所涉及的数据,组间比较方差齐,用LSD检验,方差不齐采用 Dunnett’s T3检验,以P < 0.05为统计学差异,数据结果用均数 ± 标准误(
$\bar x \pm s$ )表示。