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补体系统是人体重要的免疫防御系统之一,是由30多种广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面的蛋白质组成的,具有精密调控机制的蛋白质反应系统,其主要通过3种途径激活:经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素途径。补体系统正常激活,可在靶细胞上形成膜攻击复合物,导致靶细胞的溶解,补体的这一功能在机体的免疫系统中起重要的防御和免疫监视作用,对抵御外来微生物的入侵和维持机体平衡有重要的作用。然而该系统的过度激活将释放炎性过敏毒素C3a和C5a,具有化学诱导作用的C5a能趋化嗜中性粒细胞、中核细胞和嗜酸性粒细胞,这些细胞释放蛋白酶和具有趋化作用细胞因子,进一步聚集T、B淋巴细胞和其他炎性细胞,从而促进炎症反应的发生,引起系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肾小球肾炎等[1-2]。近年来已有研究表明[3],补体系统的激活是类风湿性关节炎中慢性滑膜炎的发病因素之一。因此,抑制补体系统的过度激活可能是治疗类风湿性关节炎的重要机制之一。
三色片为复旦大学附属中山医院的院内制剂,由雷公藤、黄芪和丹参三味药材按1∶1∶1的比例配伍组成,在临床上用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病和湿疹等结缔组织疾病。我院临床医生在长期的医疗实践中总结出来的经验方,效果显著[4]。组方中雷公藤,性味辛寒,有大毒,归肝、肾经,具有清热解毒、活血化瘀、通络止痛、杀虫止痒等功效。现代研究表明,雷公藤内酯醇对大鼠脑皮质内注射β-淀粉酶后补体C1q和C3的表达有抑制作用,表明雷公藤对补体系统有抑制作用,目前临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病和湿疹等结缔组织疾病[5]。组方中的黄芪用于脾肺气血或中气下陷之症、卫气虚所致表虚自汗、气虚血滞导致的肢体麻木、关节痹痛等症,可联合治疗类风湿性关节炎[6]。黄芪在治疗2型糖尿病大鼠的研究中发现其能降低补体C3的水平,表明其对补体系统具有一定的调节作用[7-8]。丹参是最常用的活血化瘀中药之一,具有祛瘀止痛,养血安神的功效,现代药理学研究表明其还具有保护肝脏的功能[9],可拮抗雷公藤的肝毒性。本研究通过经典途径抗补体活性测定方法筛选出三色片醇提物的乙酸乙酯部位抗补体活性最佳,并采用UPLC-Q-TOF-MS法对该部位的化学成分进行结构表征,为三色片抗补体活性药效物质基础及治疗补体过度激活相关疾病提供科学依据。
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分别对三色片醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行经典途径的抗补体活性测定,以肝素为对照品,结果发现乙酸乙酯部位的抗补体活性最好,其抗补体活性略低于肝素钠,其次是正丁醇部位,结果见表1。
编号 研究对象 抗补体活性(CH50,μg/ml) 1 肝素 14.4±1.2 2 三色片-石油醚部位 − 3 三色片-乙酸乙酯部位 233.9±10.1 4 三色片-正丁醇部位 344.0±14.5 注:“—”表示该部位无抗补体活性。 -
精密吸取对照品溶液和供试品溶液2 μl,采用“2.1”项下的色谱与质谱条件对样品进行分析,通过正、负离子全扫描,获得正、负离子模式下的总离子流图,见图1。
通过与对照品比对,分子离子峰质谱数据解析,与参考文献比对,共鉴定出三色片醇提物乙酸乙酯部位42个化合物,结果见表2。
化合物
编号tR/min 分子式 理论值(m/z) 模式 实测值(m/z) 误差(×10−6) 碎片离子(m/z) 化合物名称 参考文献 1 3.54 C7H6O3 139.039 0 [M+H]+ 139.039 4 3.0 121.028 7 原儿茶醛 [10] 2 4.76 C21H27N3O3 370.212 5 [M+H]+ 370.214 3 4.8 249.124 6,160.112 6,95.013 3,166.086 6,100.076 2,91.054 8 南蛇藤糠酰胺碱 [11] 3 6.63 C22H22O10 447.128 6 [M+H]+ 447.130 4 4.2 285.077 5,270.053 5,253.050 8,225.055 6,137.023 5 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 [12] 4 7.04 C23H29N3O2 380.233 3 [M+H]+ 380.235 1 4.8 176.106 9,160.112 6,105.033 8,100.076 5 苯代南蛇碱 [11] 5 9.41 C9H10O5 197.045 6 [M-H]− 197.044 7 −4.2 179.038 3,135.044 3 丹参素 [10] 6 9.42 C9H8O4 179.035 0 [M-H]− 179.034 2 4.7 135.044 8 咖啡酸 [13] 7 11.16 C16H12O4 431.133 7 [M+H]+ 431.136 3 6.1 269.082 6,253.050 3,225.055 5,213.091 7,197.060 2,136.014 6,118.041 7 芒柄花苷 [12] 8 12.71 C16H12O5 285.075 8 [M+H]+ 285.077 4 5.7 270.053 4,253.050 3,225.055 3,137.023 5 毛蕊异黄酮* [12] 9 12.76 C17H16O5 301.107 1 [M+H]+ 301.109 0 6.4 167.070 8,152.047 3,147.043 2,105.034 0,123.043 3 astrapterocarpan [12] 10 13.06 C20H24O6 361.164 6 [M+H]+ 361.166 5 5.5 269.154 3,227.108 3,185.096 9,157.101 7,129.070 3,91.054 9 雷公藤甲素* [14-15] 11 13.92 C17H14O6 315.086 3 [M+H]+ 315.088 1 5.6 300.064 7,243.065 5,167.034 2 熊竹素 [16] 12 18.21 C18H12O7 341.065 6 [M+H]+ 341.066 9 3.9 295.060 7,277.050 9,249.056 0 丹酚酸G [17] 13 19.76 C26H20O10 491.098 4 [M-H]− 491.097 0 −2.9 311.054 9,293.044 6,267.064 6,135.044 7 丹酚酸C [18] 14 21.46 C16H12O4 269.080 8 [M+H]+ 269.082 7 4.1 253.015 3,237.052 6,225.055 5,213.092 3,136.015 9,118.041 7,197.060 2 芒柄花素 [12] 15 22.57 C36H45NO17 764.276 0 [M+H]+ 764.278 3 2.9 746.276 1,686.246 3,644.235 1,206.081 7,188.070 9,178.086 5 aquifoliunine E-Ⅲ [14] 16 23.45 C20H22O6 359.148 9 [M+H]+ 359.150 7 4.9 267.138 0,225.019 5,183.079 9,128.061 8,91.054 3 雷公藤内酯酮* [19] 17 24.01 C38H47NO19 822.281 5 [M+H]+ 822.284 1 3.2 804.275 8,204.066 2,176.071 4 alatusinnine [20] 18 25.01 C39H45NO19 832.265 9 [M+H]+ 832.269 0 3.8 804.273 3,194.081 9,176.071 2 hypoglaunine E [11] 19 26.14 C41H68O14 829.458 0 [M+COOH]− 829.460 7 3.3 783.457 9,621.404 3,489.357 2 黄芪甲苷* [14] 20 28.19 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.290 3 3.8 788.279 5,686.247 0,206.082 1, 178.086 5 雷公藤定宁 E [20] 21 28.65 C39H45NO18 816.271 0 [M+H]+ 816.273 9 3.6 798.261 9,756.250 9,206.081 3,178.086 1,160.075 2 1-去乙酰基雷公藤吉碱 [11] 22 28.70 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 2,489.356 8 黄芪皂苷Ⅱ [13] 23 29.09 C41H47NO20 874.276 4 [M+H]+ 874.278 5 2.3 856.269 2,846.282 9,828.272 3,674.245 1,204.065 6,176.070 7 雷公藤春碱 [11] 24 29.72 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.291 2 3.8 788.280 4,686.247 4,206.082 4 peritassine A [20] 25 30.24 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 3 2.5 825.464 1,765.440 5 异黄芪皂苷Ⅱ
(异构体1)[16] 26 30.89 C19H16O4 309.112 1 [M+H]+ 309.114 2 6.7 281.667 0,263.106 0,235.076 7 丹参醛 [21] 27 31.58 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 0 异黄芪皂苷Ⅱ
(异构体2)[13] 28 32.12 C21H20O4 337.143 4 [M+H]+ 337.142 5 −2.7 309.686 6 丹参新醌丁 [10] 29 32.16 C43H49NO19 884.297 2 [M+H]+ 884.299 7 2.8 856.304 5,674.246 0,204.663 0,176.071 2 雷公藤定碱 [14] 30 32.96 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.482 4 3.5 867.481 7,825.469 8,807.464 3,765.450 6 黄芪皂苷Ⅰ [16] 31 32.99 C41H47NO19 858.281 5 [M+H]+ 858.285 4 4.6 840.275 7,798.263 8,746.269 1,738.243 5,686.248 0,206.082 5,178.087 1 雷公藤晋碱 [20] 32 33.04 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.289 7 3.8 788.278 3,686.244 4,206.082 1,728.257 0 卫矛碱 [20] 33 33.70 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.484 7 3.8 867.478 5,825.283 5,807.458 4,765.432 6 异黄芪皂苷Ⅰ
(异构体1)[16] 34 34.60 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.483 3 3.8 867.477 8,825.282 1,807.456 4,765.443 2 异黄芪皂苷Ⅰ
(异构体2)[16] 35 34.92 C46H49NO22 968.281 9 [M+H]+ 968.286 3 4.5 856.677 0,838.257 4,684.228 8,204.065 6,178.070 8 雷公藤素B [20] 36 35.01 C43H49NO18 868.302 2 [M+H]+ 868.304 6 2.7 868.364 0,850.295 8,746.268 9,686.247 6,206.082 4,178.087 1 雷公藤次碱 [20] 37 35.02 C41H47NO17 826.291 7 [M+H]+ 826.295 1 4.2 808.285 3,748.264 0,206.082 2,178.086 8 tripterygiumine Ⅰ [20] 38 35.49 C19H20O3 297.148 5 [M+H]+ 297.145 0 4.8 251.144 0,279.139 3,254.054 9,268.110 5,282.126 3 隐丹参酮 [10,17] 39 35.70 C20H28O2 299.201 7 [M-H]− 299.199 6 −6.7 283.168 2,213.090 8,201.916 0, 雷酚萜 [22] 40 35.86 C48H51NO18 930.317 9 [M+H]+ 930.321 3 3.7 912.308 7,310.111 0,206.081 8,188.071 2,178.086 5,105.033 6 ebenifoline E-Ⅱ [20] 41 36.81 C19H18O3 295.132 9 [M+H]+ 295.134 9 4.0 277.124 3,249.127 5,266.095 3,262.097 7,280.109 9 丹参酮Ⅱ A* [10,18,23] 42 37.49 C19H22O2 283.169 3 [M+H]+ 283.169 3 0 265.098 1,240.032 2,223.106 7,195.095 8,181.101 1 丹参新酮 [17,21,24] 注:*表示与对照品鉴定的化合物。 -
在乙酸乙酯部位中共鉴定出6个黄酮类化合物,其中4个黄酮苷元和2个黄酮苷,苷元为黄酮、异黄酮和紫檀烷,该类化合物在正离子模式下具有较好的响应。二级质谱中黄酮苷元易发生中性丢失,形成[M+H-H2O]+、[M+H-CO]+、[M+H-CH3]+等碎片离子,如在化合物8的二级质谱中可见m/z 270.053 4和m/z 253.050 3,则为m/z 285.077 4分别脱去-CH3和CH3OH形成的[M+H-CH3]+和[M+H-CH3OH]+碎片离子峰,m/z 225.055 3是m/z 253.050 3脱去1分子的CO形成的碎片离子峰,通过对照品的保留时间和参考文献[12]质谱数据比对确定化合物8为毛蕊异黄酮,m/z 137.023 5的碎片离子峰为异黄酮母核C环发生RDA裂解所产生。黄酮苷类易脱去糖基形成较强的分子离子峰,如化合物3(m/z 447.130 4)的二级质谱脱去糖基形成m/z 285.077 5的分子离子峰,并与化合物8(m/z 285.077 4)的二级质谱图非常相似,说明化合物3和化合物8在结构上是相似的,但化合物3的分子量多了162(C6H10O5),通过数据库比对和参考文献[12]推测化合物3则为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。化合物9(m/z 301.109 0)通过数据库比对发现两种候选化合物分别为astrapterocarpan和astraisoflavan,二级质谱中主要碎片离子峰为C环裂解产生的含A环和B环片段的碎片离子,其中,m/z 167.070 8为含B环的碎片离子峰且为基峰,进一步脱甲基形成m/z 152.047 3,m/z 123.043 3为含A环的碎片离子峰,进一步脱水形成m/z 105.034 0,m/z 147.043 2为母离子m/z 301.109 0脱去B环形成的碎片离子峰,根据m/z 167.070 8的碎片离子峰为基峰和含有m/z 147.043 2的碎片离子峰这两个特征,结合参考文献[12]的质谱数据,推测该化合物为astrapterocarpan,其相关裂解途径见图2。
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在乙酸乙酯部位中鉴定出7个三萜皂苷类化合物,在负离子模式下均具有较好的响应,一级质谱中产生[M+COOH]−的准分子离子峰,二级质谱中产生较强的[M-H]-碎片离子峰和脱去糖基的较弱的分子离子峰。化合物19在负离子模式下产生的准分子离子峰为[M+COOH]−(m/z 829.458 0),二级质谱中产生m/z 783.457 9[M-H]−峰,脱去1分子六碳糖(C6H10O6)形成m/z 621.404 3的碎片离子峰,m/z 489.357 2则为m/z 621.404 3进一步脱去1分子五碳糖(C5H6O5)后形成的苷元碎片离子峰,推测其苷元为9,19-环阿尔廷烷,通过对照品的保留时间,参考文献[13]的离子碎片比对确定该化合物为黄芪甲苷。
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三色片提取物中共鉴定出16个生物碱类化合物,均来自雷公藤药材,在正离子模式下具有较好的响应,一级质谱中产生[M+H]+的准分子离子峰,二级质谱发现该类型的化合物容易脱去H2O、CO和CH3COOH等中性小分子而产生碎片离子峰,多数生物碱含有吡啶二羧酸部位的碎片离子峰。如化合物23在正离子模式下产生m/z 874.278 5的准分子离子峰,二级质谱中产生脱去1分子CO的m/z 846.282 9的基峰,脱去1分子H2O的m/z 856.2692的碎片离子峰和脱去1分子HCOOH的m/z 828.272 3的碎片离子峰,m/z 674.245 1峰为m/z 846.2829脱去C5H4O3侧链和CH3COOH形成的碎片离子峰,m/z 204.065 6峰为大环开裂产生的吡啶二羧酸部分脱水产生的碎片离子,该离子进一步脱羧形成m/z 176.070 7的碎片离子,通过数据库和参考文献[11]质谱数据的比对,推测化合物23为雷公藤春碱。化合物31在正离子模式下产生m/z 858.285 4的准分子离子峰,二级质谱中产生脱去1分子H2O的m/z 840.275 7的碎片离子峰,准分子离子峰脱去1分子CH3COOH形成较强的m/z 798.263 8峰,在进一步脱去1分子CH3COOH形成738.243 5峰,准分子离子峰m/z 858.285 4脱去FuOH(C5H4O3)侧链形成的m/z 746.269 1的碎片离子峰,再进一步脱去1分子CH3COOH,形成m/z 686.248 0的碎片离子,m/z 206.082 5峰为大环开裂产生的吡啶二羧酸部分脱水产生的碎片离子,该离子进一步脱羧形成m/z 178.087 1的碎片离子,通过数据库和参考文献[20]质谱数据的比对,推测化合物31为雷公藤晋碱。雷公藤晋碱中吡啶二羧酸部分较雷公藤春碱中少一个羟基,故其易产生m/z 206.0825的碎片离子峰,并通过脱羧产生m/z 178.087 1峰。两种化合物的质谱图见图3。以雷公藤晋碱为例,解析此类化合物的裂解规律,见图4。因此得出吡啶二羧酸部分含有羟基的生物碱会产生m/z 204系列的特征碎片离子峰,不含羟基的生物碱则产生m/z 206系列的特征碎片离子峰。
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本研究共鉴定出8种萜类化合物,其中源于丹参药材中的5种萜类成分,丹参中的萜类化合物因其结构中主要含有羟基,羰基等取代基,所以质谱碰撞中主要丢失H2O,CO和-CH3等中性分子,产生一系列的碎片离子峰。化合物41在正离子模式下产生m/z 295.134 9的[M+H]+准分子离子峰,二级质谱中产生脱去1分子甲基形成的m/z 280.1099的碎片离子峰,在此基础上有丢失1分子水形成m/z 262.097 7峰,准分子离子峰脱去1分子H2O或脱去1个-CHO形成m/z 277.124 3峰或m/z 266.095 3峰,m/z 249.127 5峰是m/z 277.124 3脱去1分子H2O形成的碎片峰,通过对照品的保留时间和参考文献[10,18,23]数据比对,鉴定该化合物为丹参酮Ⅱ A,其质谱裂解规律见图5。
来源于雷公藤药材中的3种二萜类成分,该类化合物的二级质谱中出现一系列的脱水、脱CO和异丙基等碎片离子峰。化合物11在正离子模式下产生m/z 361.166 5的准分子离子峰,脱去2分子H2O和2分子CO形成m/z 269.154 3的碎片离子峰,m/z 227.108 3为m/z 269.154 3脱去1分子CH2CHCH3形成的碎片离子,其进一步脱1分子H2O和HCHO形成m/z 185.096 9的碎片离子,通过对照品比对和参考文献[14-15]的质谱数据,确定化合物10为雷公藤甲素。化合物18在正离子模式下产生m/z 359.148 9的准分子离子峰,脱去2分子H2O和2分子CO形成m/z 267.138 0的碎片离子峰,m/z 225.019 5为m/z 267.138 0脱去1分子CH2CHCH3形成的碎片离子,其进一步脱1分子H2O和HCHO形成m/z 183.0799的碎片离子,通过对照品比对和参考文献[19]的质谱数据,确定化合物16为雷公藤内酯酮。化合物39在负离子模式下产生m/z 299.199 6 的准分子离子峰,二级质谱中产生m/z 283.168 2的碎片离子, 提示为丢失1个-CH3后形成双键产生的碎片离子峰,A环发生RDA裂解产生m/z 213.090 8的碎片离子峰,通过数据库比对和参考文献[22]的质谱数据,推测化合物39为雷酚萜。
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在正负离子模式下共鉴定出乙酸乙酯部位中5种酚酸类成分,均来自于丹参药材,参考文献[18]报道的丹参中酚酸类成分的裂解规律发现,酚酸类化合物主要含有羰基、羧基和羟基,所以在质谱碰撞中易丢失CO、H2O和CO2的中性碎片;丹参素和咖啡酸作为基本母核而其他的水溶性酚酸类化合物大多数为这两者的聚合或缩合产物,主要为缩酚酸类的成分,在质谱碰撞中易丢失[M-H-180]−和[M-H-198]−中性碎片;含有羧基的单体化合物在负离子模式下会产生135[C8H7O2]−和179[C9H7O4]−的特征性碎片。化合物5中,在负离子模式下产生m/z 197.044 7的[M-H]−准分子离子峰,二级质谱进一步产生丢失1分子H2O和1分子CO2,形成的m/z 179.038 3和m/z 135.044 3的碎片离子峰,推测出结构中含有羧基,结合其精确分子量和参考文献[10]质谱数据,推测该化合物为丹参素。化合物12中,负离子模式下产生m/z 491.097 0的[M-H]−准分子离子峰,二级质谱中产生m/z 311.054 9和m/z 293.044 6的碎片离子峰,分别为[M-H-180]−和[M-H-198]−, m/z 267.064 6峰为m/z 311.054 9脱去1分子CO2所产生,根据m/z 135.044 7峰推测结构中含有羧基,结合其精确分子量和参考文献[18]质谱数据的比较,推测该化合物为丹酚酸C。化合物1中,正离子模式下给出m/z 139.039 4的[M+H]+准分子离子峰,脱去1分子H2O形成m/z 121.028 7的碎片离子峰,通过数据库比对和参考文献[10],推测该化合物1为原儿茶醛。化合物13中,在正离子模式下产生m/z 341.066 9的[M+H]+准分子离子峰,脱去1分子CO2形成m/z 295.060 7的碎片离子峰,m/z 277.050 9和m/z 249.056 0的碎片离子峰是m/z 295.060 7峰分别脱去1分子H2O和1分子CO2形成的,通过数据库比对和参考文献[17]质谱数据,推测该化合物为丹酚酸G。