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嘧啶类化疗药物在肿瘤治疗中的地位越来越重要,其代表药物5-氟尿嘧啶及其口服前药卡培他滨更受到了广泛关注,体内二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)是此类药物代谢的限速酶之一[1],前瞻性评价DPD的总体活性有利于提高药物疗效及减少患者的毒副反应,对临床具有重要意义。内源性物质尿嘧啶(U)是体内DPD的天然底物,在此酶的催化下生成二氢尿嘧啶(UH2),并最终通过尿液排出体外。测定血浆中U和UH2的含量,并通过(UH2)/(U)比值计算,可从代谢物的角度评价DPD的活性[2]。临床上常用评价DPD酶活性的方法是测定患者的基因表型,DPD的编码基因DPYD序列中包含了多达7 600个多态位点,使得DPD酶的活性在人群中是高度可变的[3]。不同的突变位点及不同位点的组合给临床检测带来了极大的困难。到目前为止,也只有DPYD*2A的多态性被用于临床实践,用来筛选出5-氟尿嘧啶代谢严重不良的患者,避免严重的毒副反应[4]。单一应用基因的多态性来评价DPD酶的活性在临床上存在一定的困难,基因的多态性并不能直接同下游的酶的活性联系起来,两者并没有完全对等的关系。基因需通过转录、翻译和蛋白的修饰之后才能发挥作用。基因多态联合下游代谢物的含量测定更能准确的评价DPD酶的活性[5]。目前常应用液相色谱-串联质谱联用法对人血浆或干燥唾液中U和UH2浓度进行检测[6-11],但所报道的方法均有一些复杂或难以重现。本研究成功的建立了一种灵敏、高效、准确、重现性好,且能同时测定人血浆中U和UH2浓度的UHPLC-MS/MS方法,为体内DPD总体活性提供更客观有效的评价途径。
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U和UH2的出峰时间以及峰型良好,代替血浆经过前处理后,对待测组分的测定没有干扰,内标对分析物的测定也没有干扰,且能很好分离,结果见图1。
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U和UH2的线性范围是10.0~1 500.0 ng/ml,以空白BAS中U和UH2的浓度为横坐标(X),U和UH2与内标化合物氯尿嘧啶的峰面积比为纵坐标(Y),进行最小二乘法加权(权重系数为1/χ2),U和UH2的线性回归方程分别是Y=0.27X+0.0022、Y=0.58X+0.0380,r均>0.990,表明线性关系良好。
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取定量下限、低、中、高标准添加血浆样本按照前处理方法进行处理,每个浓度样品平行制备5份进行分析,连续3 d重复操作,根据当天的标准曲线计算当天实测样本浓度,计算样本在低、中和高浓度下的日内、日间精密度和准确度,结果显示,精密度和准确度的偏差均在15%左右。准确度相对偏差在20%范围内时,最低定量下限精密度偏差不大于20%,结果见表1。
分析物 标示浓度 (ng/ml) 日内 日间 测定浓度 (ng/ml) 精密度(CV%) 准确性(RE%) 测定浓度 (ng/ml) 精密度(CV%) 准确性(RE%) 尿嘧啶 10 10.2±0.38 3.74 2.58 10.12±0.78 7.70 1.18 20 20.63±1.21 5.87 3.15 19.97±1.35 6.74 −0.16 500 529.73±4.64 0.88 5.95 484.32±35.72 7.37 −3.12 1000 1093.33±25.10 2.30 9.33 1098.25±25.16 2.29 9.82 二氢尿嘧啶 10 10.32±0.71 6.86 3.18 10.28±0.65 6.37 2.77 20 19.98±2.19 10.95 −0.12 19.86±1.85 9.31 −0.72 500 517.51±10.69 2.07 3.50 515.66±10.36 2.01 3.13 1000 1079.83±17.91 1.66 7.98 1080.11±24.50 2.27 8.01 -
取低、高2个浓度的样本进行基质效应和提取回收率考察,结果显示,U、UH2及内标氯尿嘧啶的基质效应和提取回收率良好,结果均较稳定,结果见表2。
分析物 标识浓度(ng/ml) 基质效应 提取回收率 平均基质效应 CV(%) 平均回收率 CV(%) 尿嘧啶 1000 101.00 6.15 94.98 9.01 20 99.99 3.63 100.01 7.64 二氢尿嘧啶 1000 85.72 2.07 106.47 1.58 20 93.58 4.53 99.54 9.77 -
考察低、高2个浓度的血浆样品经历3次冷冻与解冻循环的稳定性、血浆样品在室温(25 ºC)放置6 h后经样品处理后稳定性和血浆样品经样品处理后室温放置24 h的稳定性,结果显示,3次冻融、6 h室温(25 ºC)条件下和24 h放置自动进样器中的稳定性均符合要求,结果见表3。
分析物 冻融3次 室温放置6 h 置自动进样器24 h 低 高 低 高 低 高 尿嘧啶 100.71 98.34 93.49 106.60 108.20 107.99 二氢尿嘧啶 92.67 92.64 93.61 107.26 106.97 107.15 -
应用本研究所建立的方法,对8名健康成人的血浆样本测定分析,在样本实测过程中, 同时插入已知浓度的随行质控样本(QC样本), 随时监控样本测定的准确度。U和 UH2 浓度测定结果见图2。