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细胞间隙连接(Intercellular gap junction, GJIC)是一种存在于人体所有细胞中的膜通道,由连接蛋白(connexins, Cxs)形成,并负责转移生物活性分子、代谢物和相邻细胞或细胞与细胞外环境间的盐离子,对细胞的增殖、分化及机体内环境稳定、新陈代谢、生长发育起至关重要作用[1]。实验证实小鼠骨髓、肝脏及脾脏基质中有11种不同的连接蛋白表达,但人类骨髓基质中仅仅有3种Cxs (Cx31、Cx43、Cx45)表达。多项实验均证实Cx43在支持正常造血过程中具有重要作用,而我们前期的研究发现,Cx43在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的发病过程中具有重要作用,患者骨髓微环境中的Cx43表达水平较正常明显升高,骨髓瘤细胞与成骨细胞相互作用后可通过由Cx43组成的GJIC促进其迁移,上调Cx43表达对多发性骨髓瘤细胞的增殖及迁移均起到促进作用,Cx43表达异常与骨髓瘤融合细胞发生相关[2-3]。然而Cx43在MM细胞生存及耐药中的作用尚未阐明,尤其在多发性骨髓瘤干细胞及其与微环境中作用尚不明确。有鉴于此,本研究分离、培养MM患者及正常志愿者来源骨髓间充质干细胞(MM-MSCs、ND-MSCs),在直接共培养条件下观察MM干细胞样细胞生物学特性的变化及MM-MSCs对MM干细胞样细胞的生存及耐药的作用,并探讨其可能机制。
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细胞株:MM细胞株RPMI 8226、U266、XG4、XG7(苏州大学生物技术研究所张学光教授惠赠);试剂:FBS、PBS、LG-DMEM完全培养液、RPMI1640培养基(美国Gibco公司);Midi MACs系统(德国Milteyni公司);Hoechst33342(美国Sigma公司);抗Cx43及GAPDH一抗(美国CST公司);RNeasy kit试剂盒、QuantiTect reverse transcriptase kit试剂盒、TopTaq Master Mix Kit 试剂盒(美国Qiagen公司);Cytometric Beads Array试剂盒(美国BD公司)。
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参考文献[4]的方法,采用Ficoll分离MM患者及正常志愿者骨髓单个核细胞(BM-MNCs),用含10%FBS的LG-DMEM完全培养液培养,观察细胞状态,72 h后首次换液,以后根据情况每2~3 d,换液1次。待细胞生长至80%融合后,胰酶消化传代。传至第三代后收获细胞进行后续实验,剩余细胞标记后冻存于液氮罐中备用。志愿者及患者骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的分离、扩增和鉴定在知情同意下获得,并经医院伦理委员会批准。
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RPMI 8226、U266采用含有10% FBS的RPMI1640培养基培养。XG4、XG7采用含有10% FBS、1 ng/ml IL-6的RPMI1640培养基培养。原代MM细胞来自6例初诊MM患者骨髓:用Ficoll分离BM-MNCs,并用Midi MACs系统纯化,留取CD38+、CD138+细胞,操作按说明书进行,分选后的细胞采用流式细胞术(FCM)检测其纯度,CD38+、CD138+细胞≥90%,采用含有10% FBS的RPMI1640培养基培养。观察细胞状态,48 h后首次换液,以后根据情况每1~2 d,换液1次。传至第三代后收获细胞进行后续实验,剩余细胞标记后冻存于液氮罐中备用。
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取对数生长期F3代MM-MSCs及ND-MSCs,用PBS洗涤后,调整细胞浓度为2.0×106/ml,每取100 μl细胞悬液,分别加入PE标记的CD90、CD73、CD44、CD105、CD34、CD45及HLA-DR,阴性对照为PE标记的同型IgG,室温下孵育30 min,PBS洗涤2次后,FCM上机检测。
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按文献[5]报道的方法,分别取RPMI 8226、U266、XG4、XG7及原代MM细胞,调整细胞浓度为106/ml,加入浓度为1 mg/ml的Hoechst33342,调整其终浓度为5 μg/ml,混匀后置于37 ℃水浴箱中避光孵育120 min,期间数次晃动离心管。对照组于此步骤中加入终浓度为50 μmol/L维拉帕米同时孵育。离心后PBS洗涤,用含碘化丙啶(2 μg/m1)的4 ℃预冷PBS重悬细胞,并置于冰浴中。FCM上机检测,激发波长为350 nm,采集波长为450 nm(蓝光)和675 nm(红光),通过与对照组比较,选取染色偏弱部分的细胞即为SP细胞。SP细胞分选按上述步骤准备细胞,ALTRA流式细胞仪更换鞘液并用酒精进行清洗后换为双蒸水冲洗;分别上Hoechst33342管和Hoechst33342+verapamil管进行检测,FCM选择SP分选方案,调整分选参数,全程需要振荡,分选结束后在无菌条件下分别收集主群细胞(MP)和侧群细胞(SP),备用。
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分别收集RPMI8226、SP细胞、ND-MSCs、MM-MSCs、SP细胞+ND-MSCs、SP细胞+ND-MSCs+25 mmol/L α-GA、SP细胞+MM-MSCs和SP细胞+MM-MSCs+25 mmol/L α-GA各组细胞,用预冷的PBS洗涤细胞3次,加入细胞裂解液,置4 ℃作用30 min,12000 g/min离心10 min,收集上清液,BCA法测定蛋白浓度,加入4×SDS凝胶加样缓冲液混匀,煮沸10 min使蛋白变性。然后,行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并转移至PVDF膜上,封闭1 h后,分别与抗Cx43及GAPDH一抗4 ℃孵育过夜,TBS液洗涤后再与HRP标记的二抗共孵育1 h,洗涤后,应用ECL化学发光法显象和Image图象分析软件分析。
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采用碘化吡啶(PI)法。实验分组:①SP细胞+MM-MSCs;②SP细胞+MM-MSCs+25 mmol/L 18α甘草次酸(α-GA);③对照组为RPMI 8226细胞。实验设3复孔,FCM分析其DNA含量,CellQuest软件分析结果。
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采用甲基纤维素半固体培养法。实验分组:①SP细胞+MM-MSC组;②SP细胞+MM-MSC+25 mmol/L α-GA组。分别调整SP细胞和MM-MSC细胞浓度为4×105/ml和2.0×106/ml,与等量的2%甲基纤维素混均后,接种于6孔板,每孔总体系2 ml;置饱和湿度、37 ℃的CO2培养箱中培养,14 d取出,置倒置显微镜下记录集落数,≥50细胞为集落,≤50则为簇。
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采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法。实验分组:①RPMI 8226组;②新鲜分离SP细胞组;③SP细胞+MM-MSC组;④SP细胞+MM-MSC+25 mmol/L α-GA组。收集各组细胞,操作按试剂盒说明进行。简述如下:采用RNeasy kit试剂盒提取RNA样本,取1μg RNA进行逆转录,按等量cDNA进行PCR反应。所有引物序列均由上海生物工程公司设计并合成,采用β-actin为内参。β-actin上游引物 5′-TCCTGTGGCATCCACG AAACT-3′,下游引物 5′-GAAGCATTTGC GGTGGACGAT-3′,其它引物见表1。PCR扩增条件均为:94 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s,共35个循环。取4 μl PCR产物、Marker 3.5 μl分别加样于2.0%琼脂糖凝胶中电泳,电压100V电泳30~60 min,紫外投射仪观察目标条带,摄影,图象分析软件Smartview2001分析处理结果。
基因 引物序列 c-myc 5′CTTCTCTCCGTCCTCGGATTCT
3′GAAGGTGATCCAGACTCTGACCTTKlf-4 5′GCAAGTCCCCTCTCTCCATTA
3′GTAAGGTTTCTCGCCTGTGTGOct-4 5′GGAGATATGCAAAGCAGAAACC
3′CTCAAAATCCTCTCGTTGTGCSox-2 5′CGGCAACCAGAAAAACAGC
3′TCTCCGTCTCCGACAAAAGT -
采用CBA检测法。取对数生长期MM-MSCs,调整细胞数1×105/ml 接种于6孔板,培养箱静置4 h弃上清,并将不同MM细胞按1×105/ml的浓度接种该孔中,每孔2 ml,分组为:①RPMI 8226细胞;②SP细胞+MM-MSCs;③SP+MM-MSCs+α-GA(25mmol/L);④MM-MSCs。每组设3个复孔,培养24 h后收集培养上清,利用CBA技术测定上清中IL-6、IL-10、TGFβ、bFGF和IL-17的变化。
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采用annexinV/PI标记细胞流式术分析法。取对数生长期MM-MSC细胞,调整细胞数4×105/孔接种于24孔板;RPMI8226或SP细胞,调整细胞数2×104/孔接种于24孔板,培养箱静置4 h后去上清,分组如下:①RPMI8226;②RPMI8226+硼替佐米(BTZ);③SP+BTZ;④SP+MM-MSC+BTZ;⑤SP+MM-MSC+BTZ+α-GA。所有实验组BTZ及α-GA的终浓度分别为20 nmol/L和25 mmol/L,培养24 h后收集细胞,FCM检测细胞凋亡,实验设5复孔。
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所有数据采用Graphpad Prism 5.0 统计处理软件分析,以均数±标准差表示。组间分析采用t检验,P<0.05 为差别具有统计学意义。
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分离培养获得MM-MSCs及ND-MSCs,表面抗原提示两者均为高表达CD73(98.0%)、CD44(100%)、CD90(99.8%)和CD105(100%),基本不表达CD34(0.3%)、HLA-DR(0.2%),细胞形态两者无明显差异。见表2和图1。
表面抗原 CD73 CD44 CD90 CD105 CD34 HLA-DR 表达率(%) 98.00 100 99.80 100 0.30 0.20 蛋白印迹试验证实SP细胞仅表达极少量的Cx43分子,而RPMI 8226细胞则表达较高水平的Cx43,两者具有显著性差异(P<0.001);MM-MSCs较ND-MSCs表达Cx43明显较多,但不具有统计学意义(P>0.05);SP细胞与MM-MSCs共培养后,其Cx43表达均有显著上调(P<0.001);阻断GJ后,SP细胞的Cx43表达则呈现明显下调(P<0.001),详见图2。
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本研究对6例MM患者的原代细胞及4种MM细胞株的检测提示,采用Hoechst 33342染色后应用FCM技术可将MM细胞分为2群,即主群细胞(MP)和侧群细胞(SP)[6]。所有MM细胞均存在不同比例的SP细胞。MM细胞株中SP细胞含量分别为1.783 %、0.8256 %、0.082 %、0.177 %,而原代细胞不具备可重复性,鉴于RPMI 8266细胞中SP细胞含量较多,且稳定,此后实验采用的SP细胞均来自RPMI8226,详见图3。
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结果分析提示SP亚群中处G0期细胞比例显著高于MP亚群,分别为(44.34±1.7) %和(28.49±1.1) % ,提示SP亚群中包含更多处静止期的MM细胞。与MM-MSCs共培养后发现MM-MSCs具有促进SP亚群细胞进入G0期的作用,其G0期细胞达(82.6±0.1) % (P<0.001),而加入间隙连接抑制剂α-GA后,MM-MSCs对SP亚群的这一作用减弱,细胞进入增殖周期者增多,G0期细胞降至(63.42±3.86) % (P<0.01),详见图4。
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我们利用克隆形成实验分析SP细胞体外形成集落的能力,SP细胞单独培养、与ND-MSCs共培养、与MM-MSCs共培养、与ND-MSCs共培养体系中加入通道阻断剂,与MM-MSCs共培养体系中加入通道阻断剂后单克隆直径、克隆形成数、克隆形成率见表3。结果显示出与MM-MSCs共培养的SP细胞有更强的克隆形成能力。加入通道阻断剂后克隆形成能力均表现出一定程度的下降,单细胞克隆直径减小,克隆形成率降低,见图5。
组别 单克隆直径
(cm)克隆形成数 克隆形成率
(/2000)SP 0.28±0.16 1722±127 86%±6% SP+ND-MSCs 0.33±0.14 1858±89 93%±4% SP+MM-MSCs 0.38±0.21 1900±85 95%±4% SP+ND-MSCs+GA 0.25±0.22 1532±112 77%±6% SP+MM-MSCs+GA 0.31±0.17 1755±76 88%±4% -
CBA分析显示,MM-MSCs单独培养24 h后,其培养上清中存在高水平的IL-6,较低水平的TGF-β、bFGF和IL-17,基本无IL-10分泌;RPMI 8266细胞培养24 h后上清中可以测得较低水平的TGF-β及少量bFGF、IL-17、IL-6及IL-10;共培养24 h后,其上清中IL-6、IL-10和TGF-β水平较前明显升高(P<0.05),尤其是IL-6和IL-10水平较单独培养时显著升高(P<0.01),bFGF和IL-17共培养前后则无明显变化;加入GJ阻断剂后,细胞因子IL-6、IL-10和TGF-β的分泌有所降低(P<0.05),见图6。
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RT-PCR检测发现RPMI8266存在一定量c-myc、KIF4、SOX2和Oct-4基因表达,但SP细胞亚群中该类基因表达明显上调,两者具有显著性差异(P<0.05),将SP细胞与MM-MSC共培养后,可观察到c-myc、KIF4和SOX2基因表达的显著上调(P<0.001),而Oct-4基因表达下调,加入GJ阻断剂后,原上调的基因均有不同程度下调,但无明显区别(P>0.05),见图7。
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体外PI/Annexin V检测显示,RPMI 8226的MP细胞对BTZ诱导的细胞凋亡敏感,而对SP细胞敏感性较差,其凋亡率分别为(66.8±0.77)%和(25.9±0.86)%,P<0.001。与MM-MSCs直接共培养后,BTZ诱导的凋亡作用较单独培养明显减弱(P<0.05),MM-MSCs具有一定保护作用,加入GJ阻断剂后,可部分恢复MM细胞对硼替佐米的敏感性,证实MM-MSCs可保护骨髓瘤细胞免受抗肿瘤药物影响,而GJIC在其中可能起到一定作用,见图8。
Role of intercellular junctions in the biological behavior of SP cells of multiple myeloma
doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105104
- Received Date: 2021-05-22
- Rev Recd Date: 2021-12-10
- Available Online: 2022-07-27
- Publish Date: 2022-07-25
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Key words:
- multiple myeloma /
- gap junction connexin /
- tumor microenvironment
Abstract:
Citation: | WANG Ziyan, ZHANG Xiaohui, RUI Mingzhong, ZHOU Min, FU Jinxiang. Role of intercellular junctions in the biological behavior of SP cells of multiple myeloma[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 326-334. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202105104 |