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消痰通腑方应用于治疗胃肠癌前病变患者已有十余年,能够延缓胃肠癌前患者向肿瘤的进展,同时对脓毒症等危重症患者的胃肠功能恢复有较好疗效[1-5]。该方剂由法半夏、生大黄、制大黄、制南星、重楼和黄连六味中药配伍组成,法半夏、制大黄为主药,旨在消痰止呕、泄下通俯之意。半夏乃燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之良药,法半夏为半夏的炮制品,倍其化痰之力;制大黄为生大黄炒制,泻下力缓,能通达肠腑而推陈出新,又不伤正气,两者合用,既燥湿化痰,又缓消积滞,达消痰通腑之功。黄连既能泻脾胃之火,又能燥痰饮之湿。
目前对该方剂的研究集中在药理功效方面,尚无对该方剂化学成分、有效成分的相关研究报道。寻找中药复方的临床药效基础,是长期困扰中医人临床研究的难点。超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF/MS)是一种简便、快速、高灵敏度的现代分析技术,能够提供化合物的精确分子量、元素组成以及离子碎片信息(MS1和MS),广泛用于中药化学成分的快速分析和鉴别[6-7]。本研究拟采用此方法对消痰通腑方的化学成分开展研究,为其质量标志物筛选和探明药效物质提供实验依据。
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精密称定免煎剂0.5 g,加入70%甲醇50 ml,超声提取30 min,得70%甲醇提取物(简称醇提液);精密称定免煎剂0.5 g,加入70~80°C热水50 ml,搅拌5 min,超声提取30 min得水提液。提取液于3000 r/min离心10 min,取上层溶液1.5 ml置离心管中,再经15000 r/min离心10 min,取上清液过0.22 μm 微孔滤膜,即得。
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精密称取适量甘草酸、芦荟大黄素等对照品,加甲醇分别制成每1 ml 含对照品1 mg的储备溶液。精密吸取上述储备溶液各10 μl,置于1.5 ml 离心管中混合,涡旋混匀,加入甲醇配制成各对照品浓度分别为10 μg/ml的混合标准溶液。
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从已有的药材化合物成分分析文献中获取该方剂各味药的成分信息,确保数据库中收录的化合物能够在已发表的文献中检索可得,在基于Agilent自带的defult文档上建立方剂化合物数据库。采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0软件对数据进行分析。
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Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),以 0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(0~3 min,5 %B;3~15 min,5 %~35 %B;15~30 min,35 %~95 %B),柱温30 °C,流速0.3 ml/min,进样量1 μl,检测波长254 nm。
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ESI离子源,分别在正、负离子模式下采集数据,采集范围100~1700 m/z。离子源温度350 ℃,毛细管电压3.5 kV(正离子)、4.0 kV(负离子),雾化气压力45 Psi,干燥气流速11 L/min,鞘气流速11 L/min,鞘气温度350 ℃,碎片电压140 V。对照品和消痰通腑方的UHPLC-Q-TOF/MS色谱图分别见图1和图2。
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在全扫描质谱图中,大多数对照品化合物在正模式下显示[M+H]+离子,或在负模式下显示[M-H]−。由于流动相中存在Na+和甲酸,部分化合物中观察到[M+Na]+和[M+HCOOH-H]−,少许化合物中观察到[M+K]+、[M+NH4]+及[M+CH3COOH-H]−。
化合物的鉴定首先使用 Agilent 10.0软件中的按化学式查找功能,根据精确质量、同位素丰度,以及上述分子离子峰进行鉴定。当有对照品时,通过比较其在图谱上的保留时间和m/z信息与对照品的相关信息进行鉴别。在没有对照品的情况下,主要根据质谱信息(包括化合物二级质谱信息)和参考文献进行初步的鉴定。根据质谱信息和参考文献进行初步鉴定时,通过导入已建立的方剂化合物数据库,利用Agilent 10.0软件进行识别,并结合Massbank、Pubchem、Chemspider等在线数据库进行辅助分析,根据化合物准确分子量及碎片信息进行判断,排除假阳性结果。例如:
化合物1:通过数据库识别到0.906 min的分子离子峰在正负离子模式下分别出现m/z 175.1193 的[M+H]+离子和m/z 173.1036的 [M-H]− 离子,软件自动生成匹配度最高分值的分子式为C6H14N4O2,说明其可能为精氨酸。其次,结合Massbank在线数据库对其二级碎片离子进行查找,发现正离子模式下可识别到158、116碎片离子,负离子模式下可识别到173、131等碎片离子,因此,推断化合物1为精氨酸,结合我们建立化合物数据库信息,判断该化合物来源于黄连或制半夏[8]。
化合物12:通过数据库识别到1.394 min的分子离子峰在正负离子模式下分别出现m/z 333.0878的[M+H]+离子和m/z 331.0672的 [M-H]− 离子,软件自动生成匹配度最高分值的分子式为C13H16O10。其次,化合物产生m/z 169没食子酸的特征碎片离子,而大黄中的简单酚酸类成分基本结构主要是没食子酸、对香豆酸、阿魏酸、对羟基苯丙酸等,因此,推测该化合物为来源于大黄的没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷[9]。
化合物44:负离子模式下在17.208 min识别到m/z 837.3886的 [M-H]− 离子,软件自动生成匹配度最高分值的分子式为C42H62O17。其次,化合物产生m/z 351的离子峰,为其结构中2 分子的葡萄糖醛酸苷键断裂形成的碎片离子m/z 351[2 × C6H8O6-H]−离子,因此,推断化合物44为甘草皂苷G2,来源于法半夏[10]。
考虑到此中药方剂以水冲服的方式,本研究还同步分析了水提液的化学成分,结果亦参见图2和表1。结果表明,70%甲醇提取物能够识别的化合物比水提液识别的化合物多10个,且化合物的峰面积也较高。与70%甲醇提取方式获得化合物相比,水提液识别的是即将吸收入血的体外化合物群的信息,而70%甲醇提取液识别的则是方剂中更多的化合物的信息,有助于解析其多成分的特征,保证消痰通腑免煎剂所含有的化合物的准确性,也有助于免煎剂生产的质量控制。
序号 质量 相对时间(min) 分子式 m/z(MS1) 部分特征离子峰 m/z (MS2) 差异(Δ ppm) 名称 来源药材 来源文献 1 174.1115 0.906 C6H14N4O2 175.1193 [M+H]+ 175,158,116 −1.01 精氨酸 黄连*,制半夏 [8,11] 174.1113 0.906 173.1036 [M-H]- 173,131 −2.40 2 192.0617 0.965 C7H12O6 191.0552 [M-H]- 191,173,111 −4.71 奎宁酸 黄连 [8] 3 251.1022 0.996 C10H13N5O3 252.1093 [M+H]+ 252,194,137 0.79 脱氧腺苷 重楼,制半夏 [11-12] 4 192.0281 1.189 C6H8O7 230.9906 [M+K]+ 1.73 柠檬酸 黄连 [12] 192.0276 1.168 191.0203 [M-H]- 191,111,103 3.14 5 332.0767 1.394 C13H16O10 333.0878 [M+H]+ 4.61 没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷 大黄* [13] 332.0746 1.395 331.0672 [M-H]- 271,169 0.30 6 170.0216 1.396 C7H6O5 171.0289 [M+H]+ 171,155,153 0.29 没食子酸 大黄* [13] 170.0216 1.520 169.0143 [M-H]- 125,111 0.42 7 131.0945 1.508 C6H13NO2 132.1018 [M+H]+ 132,86 −0.76 异亮氨酸 天南星,制半夏 [11,14] 131.0939 1.475 130.0869 [M-H]- −3.84 8 165.079 2.273 C9H11NO2 166.0864 [M+H]+ 166,120 0.60 苯丙氨酸 天南星,制半夏 [11,14] 165.0792 2.238 164.0723 [M-H]- 3.66 9 354.0946 3.752 C16H18O9 353.0874 [M-H]- 353,191 −1.13 绿原酸 黄连* [8] 10 204.0899 4.31- C11H12N2O2 205.0973 [M+H]+ 159,146 0.10 色氨酸 黄连*,制半夏 [8,11] 204.0897 4.207 203.0819 [M-H]- 142,116 −0.69 11 326.1026 4.812 C15H18O8 325.0919 [M-H]- 325,235,145 2.86 对香豆酸-O-葡萄糖苷 大黄 [13] 12 452.1327 5.06- C21H24O11 475.1211 [M+Na]+ 0.00 儿茶素-O-葡萄糖苷 /表儿茶素-O-葡萄糖苷 大黄 [13] 452.1319 4.993 451.1239 [M-H]- 451,137 −1.55 13 578.143 5.392 C30H26O12 579.1505 [M+H]+ 0.94 原花青素B2 大黄* [13] 578.1417 5.277 577.1345 [M-H]- 577,289 −1.23 14 290.0797 6.073 C15H14O6 291.0867 [M+H]+ 161 1.37 儿茶素 大黄 [13] 290.0794 5.995 289.0721 [M-H]- 245,203,187 1.04 15 194.0586 6.076 C10H10O4 217.0492 [M+Na]+ 177,145 4.68 阿魏酸 大黄 [13] 16 654.1949 6.449 C33H34O14 653.1871 [M-H]- 653,313,169 −0.77 4-( 4'-羟基苯基) -2-丁酮-O-阿魏酰-没食子酰-葡萄糖苷 大黄 [13] 17 484.0858 6.826 C20H20O14 483.078 [M-H]- 313,169 0.00 没食子酸-O-没食子酰基葡萄糖苷 大黄 [15] 18 164.0470 8.434 C9H8O3 163.0397 [M-H]- 163,155 −2.45 对香豆酸 大黄 [13] 19 564.1492 8.589 C26H28O14 565.1559 [M+H]+ 565,505 1.24 夏佛托苷 天南星 [16] 564.1478 8.556 563.1418 [M-H]- 2.13 20 322.1093 8.578 C19H16NO4+ 323.1163 [M+H]+ 265,189 3.40 格兰地新 黄连 [17] 21 284.0687 8.920 C16H12O5 285.076 [M+H]+ 242 1.05 大黄素甲醚 大黄 [18] 22 564.1871 9.192 C27H32O13 587.1756 [M+Na]+ 356,322 3.58 鼠李糖甘草苷 法半夏 [16] 23 234.0533 9.318 C12H10O5 235.0604 [M+H]+ 222,189 1.28 2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色原酮 大黄 [13] 234.0531 9.262 233.0458 [M-H]- 1.29 24 578.1641 9.686 C27H30O14 577.1554 [M-H]- 577,146 −1.55 异佛莱心苷 法半夏 [11] 25 442.0921 9.820 C22H18O10 443.0976 [M+H]+ 393,123 4.81 表儿茶素没食子酸酯 大黄 [13] 442.0901 9.820 441.0824 [M-H]- 0.23 26 550.1704 9.845 C26H18O10 549.1614 [M-H]- 283,239 0 芹糖异甘草苷 法半夏 [10] 27 446.0856 9.912 C21H18O11 469.0733 [M+Na]+ 279,248 −1.71 大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷 大黄 [15] 446.0848 9.845 445.0772 [M-H]- −0.90 28 478.1471 9.978 C23H26O11 479.1551 [M+H]+ 0.63 异莲花掌苷 大黄 [15] 478.1472 9.922 477.14 [M-H]- 313 −0.42 29 310.1058 10.092 C15H18O7 333.0949 [M+Na]+ 1.20 2-O-桂皮-β-D-葡萄糖苷 大黄 [13] 310.1055 10.002 355.1035 [M+HCOOH-H]- 345 0.00 30 234.0897 10.684 C13H14O4 235.097 [M+H]+ 235 2.13 2-(2′-羟丙基)-5-甲基-7-羟基色原酮 大黄 [13] 234.0895 10.631 233.0822 [M-H]- 1.29 31 862.1953 10.833 C42H38O20 861.1888 [M-H]- 699,654 0.46 番泻苷 B 大黄 [13] 32 320.0893 11.572 C19H14NO4 321.0991 [M+H]+ 292,234 −1.90 黄连碱 黄连 [19] 33 399.1665 12.363 C22H25NO6 422.1598 [M+Na]+ 350,336,292 4.69 秋水仙碱 天南星 [20] 34 462.1161 12.313 C22H22O11 461.1088 [M-H]- 461,331,169 −0.22 桂皮酸-O-没食子酰-葡萄糖苷 大黄 [9] 35 418.1257 13.394 C21H22O9 417.1188 [M-H]- 255,213 −0.72 异甘草苷 法半夏 [10] 36 1048.5438 14.102 C51H84O22 1071.5336 [M+Na]+ 869,577 −0.93 重楼皂苷G 重楼 [21] 1048.5457 14.078 1047.5386 [M-H]- 0.48 37 408.1422 14.182 C20H24O9 431.1314 [M+Na]+ 306,292 0.23 6-甲氧基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷 大黄 [13] 408.1424 14.112 407.1352 [M-H]- 0.98 38 432.1053 14.372 C21H20O10 455.0942 [M+Na]+ 455,292 −1.54 芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷 大黄 [13] 432.1060 14.317 431.0989 [M-H]- 1.16 39 1046.5283 14.384 C51H82O22 1047.5356 [M+H]+ 415,172 −1.43 polyphylloside III 重楼 [20] 1046.5282 14.852 1091.5286 [M+HCOOH-H]- 0.55 40 416.1109 14.554 C21H20O9 439.0999 [M+Na]+ 439,336 −0.23 大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷 大黄 [13] 416.1104 14.487 415.1032 [M-H]- −0.72 41 286.048 15.273 C15H10O6 287.0552 [M+H]+ 0.74 木犀草素 黄连* [8] 286.0484 15.216 285.0412 [M-H]- 285,215,199 2.20 42 446.1213 15.932 C22H22O10 469.1104 [M+Na]+ 469,283 −0.21 大黄素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷 大黄 [15] 284.0687 15.865 283.0616 [M-H]- 1.41 43 450.1523 17.150 C22H26O10 473.1413 [M+Na]+ 473,230 −1.06 决明柯酮-O-乙酰基葡萄糖苷 大黄 [15] 450.1528 17.097 449.1469 [M-H]- 3.56 44 838.3969 17.208 C42H62O17 837.3886 [M-H]- 661,351 −3.34 甘草皂苷G2 法半夏 [10] 45 822.4012 17.943 C42H62O16 845.392 [M+Na]+ −3.17 甘草酸 法半夏* [10] 822.4031 17.914 821.3959 [M-H]- 351,193 −0.83 46 284.0328 18.384 C15H8O6 283.0257 [M-H]- 239 3.18 大黄酸 大黄 [18] 47 884.4779 19.643 C15H20O3 907.4652 [M+Na]+ 685,292 −1.10 纤细薯蓣皂苷 重楼 [21] 884.4762 19.622 929.4748 [M+HCOOH-H]- −0.43 48 870.4622 19.768 C44H70O17 893.4502 [M+Na]+ 376,251 −0.34 重楼皂苷H 重楼 [21] 870.4607 19.622 915.459 [M+HCOOH-H]- −0.55 49 854.4664 19.773 C44H70O16 877.4557 [M+Na]+ 877,306 −1.31 重楼皂苷II 重楼 [21] 870.4646 19.750 869.4546 [M-H]- 0.69 50 738.4219 19.932 C39H62O13 783.4170 [M+HCOOH-H]- 783,146 −0.26 重楼皂苷VI 重楼 [21] 51 270.0537 20.820 C15H10O5 269.0460 [M-H]- 225,146 1.86 芦荟大黄素 大黄 [18] 52 868.482 22.136 C45H72O16 891.4746 [M+Na]+ 725,415 3.70 薯蓣皂苷 重楼 [22] 868.482 22.104 913.4809 [M+HCOOH-H]- 0.77 53 854.4668 22.323 C44H70O16 877.4572 [M+Na]+ 196,140 0.43 重楼皂苷I 重楼* [21] 854.4655 22.297 899.4609 [M+HCOOH-H]- −1.07 54 254.0577 22.790 C15H10O4 255.0647 [M+H]+ 196 −1.96 大黄酚 大黄 [18] 55 576.4428 27.329 C35H60O6 599.4282 [M+Na]+ 429,355 6.67 胡萝卜苷 天南星* [23] 576.4374 27.263 621.4349 [M+HCOOH-H]- −2.68 注:*表示在水提液中未检测出的化合物 通过上述分析方法得到55种化合物,其中,精氨酸、奎宁酸、柠檬酸、黄连碱、格兰地新、绿原酸、木犀草素、色氨酸共8个化合物来自黄连;脱氧腺苷、薯蓣皂苷、重楼皂苷G、polyphylloside III、重楼皂苷II、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、重楼皂苷I共9个化合物来自重楼;异亮氨酸、苯丙氨酸、夏佛托苷、秋水仙碱、胡萝卜苷共5个化合物来自天南星;精氨酸、脱氧腺苷、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鼠李糖甘草苷、异佛莱心苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草皂苷G2、甘草酸共10个化合物来自法半夏;没食子酸-3-O-β-D-葡萄糖苷、没食子酸、对香豆酸-O-葡萄糖苷、儿茶素-O-葡萄糖苷/表儿茶素-O-葡萄糖苷、原花青素B2、儿茶素、阿魏酸、4-( 4'-羟基苯基) -2-丁酮-O-阿魏酰-没食子酰-葡萄糖苷、没食子酸-O-没食子酰基葡萄糖苷、对香豆酸、大黄素甲醚、2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色原酮、表儿茶素没食子酸酯、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、异莲花掌苷、2-O-桂皮-β-D-葡萄糖苷、2-(2'-羟丙基)-5-甲基-7-羟基色原酮、番泻苷B、桂皮酸-O-没食子酰-葡萄糖苷、6-甲氧基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-D葡萄糖苷、决明柯酮-O-乙酰基葡萄糖苷、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚共27个化合物来自生大黄或制大黄,具体参见表1。其中,部分化合物例如精氨酸、脱氧腺苷、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸是根茎类化合物的共有化学成分,在黄连、重楼及半夏中均可以检测到,因此,根据化合物的文献检索进行了相应的归属。
Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS
doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029
- Received Date: 2021-09-06
- Rev Recd Date: 2022-03-03
- Available Online: 2022-07-27
- Publish Date: 2022-07-25
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Key words:
- UHPLC-Q-TOF/MS /
- chemical components /
- Xiaotan Tongfu formula
Abstract:
Citation: | QIN Ye, HUANG Wei, GU Yufang, ZHANG Ci’an, XIU Lijuan, TANG Jigui, ZHANG Feng, LIU Xuan. Rapid analysis of chemical components of Xiaotan Tongfu formula based on UHPLC-Q-TOF/MS[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(4): 339-346. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109029 |