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免疫介导的炎性眼前段疾病(immune-mediated inflammatory anterior ocular diseases,IIAODs)如春季结膜炎、前葡萄膜炎等是临床上较常见的眼科疾病。局部或全身性使用类固醇是控制这类疾病炎症的主要手段。然而,长期使用类固醇可能会导致白内障、青光眼等,从而存在失明的可能。因此,眼科临床越来越频繁地局部使用免疫抑制剂来治疗这类疾病。
他克莫司(tacrolimus,FK506)作为第二代免疫抑制剂代表性药物,是治疗IIAODs的主要方式之一[1-3]。目前国内上市的FK506眼用制剂为日本千寿药业生产的Talymus®,其药效容易受到泪液冲刷的影响而降低。因此,本研究研制了他克莫司阳离子微乳凝胶(FK506-loaded cationic nanoemulsion-based in-situ gel, FK506 CNE GEL),旨在利用该剂型的特性,延长药物在眼部的滞留时间,提高生物利用度,减少给药频次。本文通过HE染色处理的兔眼组织病理切片观察FK506 CNE GEL的眼部刺激性,并通过建立HPLC-MS测定兔眼房水药物浓度的方法,考察其房水药动学。
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根据本研究前期报道制备FK506 CNE GEL[4]。首先以蓖麻油(4 %,W/V)、中链脂肪酸甘油酯(6 %,W/V)作为混合油相,西他氯胺(0.02 %,W/V)作为阳离子表面活性剂,吐温−80(1 %,W/V)、泊洛沙姆188(0.1 %,W/V)作为非离子表面活性剂,甘油(2.2 %,W/V)作为渗透压调节剂,通过高压均质制得FK506 CNE(0.1 %,W/V)。而后以26 %泊洛沙姆407和12 %泊洛沙姆188共同作为凝胶基质,将FK506 CNE进一步制备成FK506 CNE GEL(0.1 %,W/V)。
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取实验兔8只,随机分为A、B两组。采用动物同体左右侧自身对比法,A组实验兔左眼滴入FK506 CNEGEL 50 μl,右眼滴入生理盐水50 μl作为对照。B组实验兔左眼滴入市售Talymus® 50 μl,右眼滴入生理盐水50 μl作为对照。给药后使兔眼被动闭合10 s,使药液与局部有充分接触。每日给药3次,连续给药2周。
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通过耳缘静脉注入空气处死实验兔后取出眼球,进行病理组织切片,详细步骤如下:① 10 %中性福尔马林固定;② 流水冲洗;③ 组织修切平面;④ 组织脱水、石蜡包埋;⑤ 石蜡组织切片;⑥ 二甲苯-无水乙醇脱蜡;⑦ 苏木素-伊红染色;⑧ 小浓度氨水返蓝;⑨ 脱水、复染、洗涤;⑩ 继续脱水后封片。光学显微镜下观察兔眼角膜,虹膜,结膜并拍照,试验结果见图1。
一般情况下,兔眼较人眼对刺激反应更为敏感。图1为显微镜下滴入FK506 CNE GEL、Talymus®及生理盐水后的兔眼角膜、虹膜及结膜结构。对比可见,滴入FK506 CNE GEL后兔眼角膜组织排列规则有序、纹理清晰;虹膜各层组织结构清晰,无明显异常;结膜组织清晰可见,未见坏死及炎性细胞浸润,与生理盐水组及Talymus®组对比无明显差异。结果表明,FK506 CNE GEL对兔眼角膜、虹膜及结膜均无明显刺激性。
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采用Agilent 1100型高效液相色谱仪,色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18 (2.1 mm×50 mm, 2.7 μm),流动相为甲醇-水(2 mmol/L醋酸铵)(90∶10, v/v),柱温为40 ℃,流速为0.3 ml/min,进样量为1 μl。
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采用SCIEX QTRAP® 5500 型高压快速液相色谱-三重串联四级杆质谱联用仪以ESI正离子电离方式检测,扫描方式为多反应监测(MRM),扫描时间为100 ms,离子源电离电压为5 500 V,离子源温度为550 ℃,雾化气流流速为7 L/min。以上述质谱条件对FK506及子囊霉素(ascomycin ,FK520)进行离子扫描,结果如表1所示。根据扫描结果,选择m/z 821.5→768.4 作为 FK506 定量分析离子对,m/z 821.5→576.3 作为其定性分析离子对;选择m/z 809.5→756.5作为FK520定量分析离子对,m/z 809.5→564.3 作为其定性分析离子对。
参数 FK506 FK520 分子量 804.2 792.4 定性分析的离子反应(m/z) 821.5→576.3 809.5→564.3 碎裂能量(CE, V) 31.2 29.0 定量分析的离子反应(m/z) 821.5→768.4 809.5→756.5 碎裂能量(CE, V) 28.0 26.1 解簇电压(DP, V) 120 45 -
精密移取房水样品30 μl置于2 ml离心管中,加入50 μl FK520内标液(100 ng/ml)及120 μl甲醇,涡旋混合,12 000 r/min离心15 min,取上清液进样分析。
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取空白房水30 μl,将一定浓度的FK506和FK520标准溶液分别加入空白房水中,按照“2.3.3”项下方法处理,记录谱图。结果如图2所示,表明房水中内源性物质对FK506的测定无干扰,方法专属性良好。
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精密移取空白房水 30 μl置于2 ml离心管中,加入不同量的100 ng/ml FK506标准溶液及50 μl FK520内标液(100 ng/ml),加入甲醇使总量达200 μl制成系列浓度50、25、10、5、2.5、1、0.5 ng/ml的FK506溶液,12 000 r/min离心15 min,液质联用仪进样分析,记录对应图谱。以FK506峰面积Ai与FK520峰面积As的比值Ai/As作为纵坐标,以FK506浓度C(ng/ml)为横坐标进行线性回归,得线性回归方程:A=0.324 75C+0.05577,r=0.999 96。结果表明FK506在0.5~50 ng/ml浓度范围内线性关系良好,定量限为0.5 ng/ml。
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配制浓度为1、10、30 ng/ml的FK506样品,按照“2.3.3”项下方法处理,于1 d内重复测定5次,连续测定5 d,考察方法的日内、日间精密度。根据测得浓度与理论浓度比值计算方法回收率,结果见表2。结果表明,日内、日间精密度RSD<2%,精密度良好。
时间 浓度
(ng/ml)序号 平均值 RSD
(%)1 2 3 4 5 日内 1 1.00 0.97 0.98 0.98 0.96 0.98 1.52 10 9.91 9.98 9.92 9.97 9.94 9.94 0.31 30 29.96 29.95 29.96 29.87 29.98 29.94 0.09 日间 1 0.99 0.98 1.97 0.96 1.01 1.18 0.37 10 9.96 9.98 9.95 9.97 9.98 9.97 0.13 30 29.98 29.96 29.96 30.01 29.95 29.97 0.05 -
配制浓度为1、10、30 ng/ml的房水样品各3份,按照“2.3.3”项下方法处理,1 d内测定。结果见表3,表明3个样品浓度RSD<2%,重复性良好。
浓度
(ng/ml)序号 平均值 RSD
(%)1 2 3 1 0.98 0.96 0.97 0.97 1.03 10 9.97 9.93 9.96 9.95 0.21 30 29.93 29.98 29.92 29.94 0.06 -
取FK506浓度为1、10、30 ng/ml样品各3份,按照“2.3.3”项下方法处理并测定,记录FK506峰面积为A1;取空白房水同法萃取,于分离的上清液中加入对应浓度等量的FK506和FK520,测定并记录FK506峰面积A2。按提取回收率公式(A1/A2)×100 %算得FK506的提取回收率。结果表明,FK506在各个浓度的提取回收率分别为(78.14±4.21)%、(78.32±4.55)%、(76.56±4.35)%,符合体内药动学研究的相关指标。
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将实验兔随机分成A、B两组,每组6只,共12只。A组实验兔(A1~A6)左眼给予Talymus®,右眼给予自制FK506 CNE;B组实验兔(B1~B6)左眼给予FK506 CNE GEL,右眼给予FK506 CNE。实验前24 h自由进食、饮水,并进行眼部检查,以确保无任何疾病。于给药点用开睑器撑开实验兔眼睑,使用移液枪往实验兔左、右眼分别滴入等量药液50 μl,按压实验兔眼睑使之被动闭合约10 s使药物分布均匀。
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采用SPSS统计软件进行独立样本t检验分析,当P<0.05时,统计学有显著性差异。实验数据均以(
$ \bar x \pm s $ )表示。 -
提前给予实验兔1 %戊巴比妥钠(0.6 ml/kg)进行耳缘静脉麻醉,并于采样前使用盐酸丙美卡因滴眼液进行局麻。接着,用镊子固定眼球后采用角膜穿刺术抽取房水,分别于给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10 h时间点采样。A1~A3实验兔于给药后0.5、1.5、2.5、4、8 h各抽取房水30 μl,A4~A6实验兔于给药后1、2、3、6、10 h各抽取房水30 μl。B1~B3实验兔于给药后0.5、1.5、2.5、4、8 h各抽取房水30 μl,B4~B6实验兔于给药后1、2、3、6、10 h各抽取房水30 μl。
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以房水样品中FK506浓度C(ng/ml)为纵坐标,以时间T(h)为横坐标作图,得药-时曲线图3及对应药动学参数表4。
药动学参数 FK506 CNE Talymus® FK506 CNE GEL AUC(ng·h /ml) 113.61±12.36* 68.25±10.82 128.34±13.09*# c max (ng/ml) 28.02±4.07 21.34±3.31 24.14±3.10 t max (t/h) 1.50±0.20* 2.00±0.17 2.50±0.25*# ka (h-1) 2.16±0.51* 1.14±0.90 0.94±0.08*# ke (h-1) 0.34±0.02* 0.41±0.05 0.32±0.02*# MRT (t/h) 3.46±0.28* 3.23±0.24 4.23±0.34*# *P<0.05,与Talymus®比较;#P<0.05,与FK 506 CNE比较 由表4可见,MRT(CNE GEL)>MRT(CNE)>MRT(Talymus®),即FK506 CNE GEL的平均滞留时间最长,表明FK506 CNE GEL在角膜的滞留时间最长。此外,AUC(Talymus®)为(68.25±10.82) ng·h /ml,AUC(CNE)为(113.61±12.36)ng·h /ml,AUC(CNE GEL)为(128.34±13.09)ng·h /ml。三者对比得AUC(CNE GEL)是AUC(CNE)的1.13倍,是AUC(Talymus®)的1.88倍,说明FK506 CNE GEL的生物利用度较高。
The eye irritation test and pharmacokinetic study of tacrolimus-loaded cationic nanoemulsion-based in-situ gel in rabbits
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202104055
- Received Date: 2021-04-13
- Rev Recd Date: 2021-06-08
- Available Online: 2023-07-14
- Publish Date: 2023-03-25
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Key words:
- tacrolimus /
- cationic nanoemulsion-based in-situ gel /
- eye irritation /
- pharmacokinetics
Abstract:
Citation: | LIN Xin, ZHANG Jialiang, ZHOU Xin, SONG Hongtao. The eye irritation test and pharmacokinetic study of tacrolimus-loaded cationic nanoemulsion-based in-situ gel in rabbits[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(3): 177-181. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202104055 |