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荜茇为胡椒科植物荜茇(Piper longum L.)的干燥未成熟果穗,为常见的药食同源中药。果穗变黑时采收,除去杂质,晒干后可入药。荜茇主要产于印度、菲律宾和越南,我国云南、广东和广西等多地也有栽培[1]。荜茇具有多种生物活性,药理实验表明其具有抗癌、抗氧化、保肝和神经系统保护等作用[1,2]。荜茇含有生物碱、黄酮、木脂素、挥发油和脂肪酸等多种化学成分, 其中最重要的化学成分为酰胺类生物碱成分[1,3-5], 而胡椒碱是其中代表性的生物碱类化合物[2,5]。研究表明,荜茇中生物碱类成分具有较强的药理活性,如抗肿瘤作用[6-8];抑制高钙高磷导致的主动脉瓣膜间质细胞钙化作用[9];大鼠肠系膜动脉血管舒张作用等[5]。同时也有研究表明,荜茇在传统用药中常用于冠心病的治疗[10]。本实验采用HPLC法对荜茇提取物中5个生物碱类成分(胡椒碱、N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺、几内亚胡椒碱、荜茇明碱和胡椒酰胺)的含量进行同时测定,并观察了荜茇提取物灌胃给药对垂体后叶素所致大鼠实验性心肌缺血的影响,为荜茇用于治疗冠心病提供实验依据。
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色谱柱为RP-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱:0~30 min,50%~100% A;30~50 min,100% A;50~55 min,100%~50% A。检测波长260 nm和343 nm,流速1.0 ml/min,柱温30 ℃。
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对照品溶液制备:精密称取5个生物碱对照品各10 mg,加入甲醇溶解并定容于50 ml棕色容量瓶中,摇匀,即得浓度为0.2 mg/ml的对照品储备液,备用。取胡椒碱溶液(浓度208.90 μg/ml), N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺溶液(稀释5倍,浓度39.59 μg/ml),几内亚胡椒碱溶液(稀释110倍,浓度1.84 μg/ml),荜茇明碱溶液(稀释9倍,浓度21.84 μg/ml)和胡椒酰胺溶液(稀释50倍,浓度4.17 μg/ml)作为定位溶液和线性溶液1。精密量取胡椒碱溶液(208.90 μg/ml), N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺(197.96 μg/ml),荜茇明碱(196.52 μg/ml)和胡椒酰胺(208.47 μg/ml)对照品储备液各5.0、1.0、0.55、0.1 ml和几内亚胡椒碱储备液稀释20倍后溶液(10.13 μg/ml)0.9 ml置于10 ml棕色容量瓶中,加甲醇定容,得线性溶液2。再将线性溶液2按2、4、8、16倍逐级稀释,摇匀,即得线性溶液3~6。
供试品溶液制备:取荜茇提取物约0.025 g,精密称定,置50 ml棕色容量瓶中,甲醇超声5 min使溶解(250 W,33 KHz),放至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀。精密移取10 ml置25 ml棕色容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.22 μm滤膜过滤,取续滤液即得。
空白样品溶液:将甲醇用0.22 μm滤膜过滤,取续滤液即得。
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分别吸取上述对照品线性溶液1~6各10 μl依次注入液相色谱仪,按“2.1.1”项下色谱条件测定,以对照品浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,结果见表1。在线性范围之内,浓度和峰面积的线性关系良好。高效液相色谱图见图1。
化合物 线性回归方程 r 线性范围(μg/ml) 胡椒碱 Y=60744550.07X+
72196.060.9995 6.53~209 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺Y=30260.88X+4536.6 0.9998 1.24~39.6 几内亚胡椒碱 Y=72122.11X+70.35 0.9998 0.058~1.84 荜茇明碱 Y=61103.03X+6392.77 0.9999 0.676~21.8 胡椒酰胺 Y=71662.81X+2764.79 0.9998 0.130~4.16 -
精密吸取10 μl线性溶液2,按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次。胡椒碱RSD为0.37%,N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺RSD为0.62%,几内亚胡椒碱RSD为0.59%,荜茇明碱RSD为0.88%,胡椒酰胺RSD为1.2%,表明仪器精密度良好。
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精密取同一供试品(批号081001)溶液,放置在室温避光条件下,分别于0、1、2、4、8、24 h测定峰面积。结果显示:胡椒碱、N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺、几内亚胡椒碱、荜茇明碱和胡椒酰胺峰面积RSD分别为1.1%、1.2%、0.51%、0.83% 和0.46%,表明本品在室温避光条件下24 h内稳定性良好。
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取同一批荜茇提取物(批号081001)6份,按供试品溶液制备方法制成样品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件测定。测得胡椒碱平均含量为56.1%,RSD为0.64%;N-异丁基-2E,4E-十八烷二烯酰胺平均含量为4.48%,RSD为1.32%;几内亚胡椒碱平均含量为0.461%,RSD为1.03%;荜茇明碱平均含量为1.73%,RSD为0.591%;胡椒酰胺平均含量为0.554%,RSD为0.814%,表明本法重复性良好。
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取6份同一供试品粉末(批号081001)约0.0125 g,精密称定,置50 ml棕色容量瓶中,甲醇超声5 min,放至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀。精密移取4.0 ml置25 ml棕色容量瓶中,并加入一定量的对照品溶液(按1∶1比例),制成样品溶液,精密吸取该样品溶液10 μl,按“2.1.1”项下色谱条件测定,计算回收率。结果见表2,表明回收率良好。
化合物 原有量
(m/μg)加入量
(m/μg)测得量
(m/μg)回收率
(%)RSD
(%)胡椒碱 540.0 500.0 1030 98.12 0.85 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺43.74 43.50 86.95 99.33 2.11 几内亚胡椒碱 4.508 4.525 9.078 101.01 1.86 荜茇明碱 16.33 16.50 32.54 98.19 1.31 胡椒酰胺 5.308 5.560 10.862 99.89 0.96 -
取3批荜茇提取物,每一批样品平行制备3份,并按“2.1.1”项下色谱条件测定,计算供试品中5个生物碱的含量。3批样品测定结果见表3。
成分 批号 平均值 RSD(%) 081001 081002 081003 胡椒碱 56.1 49.7 51.6 52.5 6.27 N-异丁基-2E,4E-
十八烷二烯酰胺4.48 4.21 4.28 4.32 3.20 几内亚胡椒碱 0.461 0.378 0.396 0.412 10.6 荜茇明碱 1.73 1.67 1.70 1.70 1.87 胡椒酰胺 0.554 0.461 0.493 0.500 9.46 -
将Wistar大鼠60只,随机分为6组,每组10只,分别为:空白对照组、模型组、盐酸地尔硫卓组(6 mg/kg)、荜茇提取物小剂量组(10 mg/kg)、荜茇提取物中剂量组(30 mg/kg)、荜茇提取物大剂量组(60 mg/kg)。
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大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯(1000 mg/kg)麻醉,然后按2.0 IU/kg经舌下静脉注射垂体后叶素造成急性心肌缺血模型,以造模前后T波变化绝对值、心率及其变化百分率为观测指标。
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荜茇提取物3个剂量组和盐酸地尔硫卓组均按1 ml/100 g连续灌胃给药大鼠7天,空白对照组和模型组给予同体积生理盐水,荜茇提取物三个剂量组和盐酸地尔硫卓组于第7天灌胃给药后1 h造模,比较各剂量组造模后T波的变化、心率及其变化百分率。
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实验数据以均数±标准差(
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ )表示,其他各组与模型组比较,采用F检验和t检验进行统计分析,P<0.05表示差异有显著统计学意义。 -
与空白对照组相比,模型组T波变化绝对值增高(表4),心率变化百分率加大(表5),差异具有显著性,表明实验造模成功;与模型组相比,盐酸地尔硫卓组(即阳性药组)T波变化绝对值降低,差异具有显著性,表明实验评价方法可行。荜茇提取物灌胃给药对垂体后叶素所致实验性心肌缺血大鼠T波变化绝对值的影响结果见表4,对心率变化百分率的影响结果见表5。
组别 造模后时间 1 min 5 min 15 min 空白对照组 0.008±0.003 0.007±0.004 0.007±0.003 模型组 0.033±0.018△△ 0.051±0.023△△ 0.053±0.022△△ 盐酸地尔硫卓组 0.024±0.022 0.018±0.014** 0.020±0.016** 小剂量组 0.031±0.031 0.042±0.04 0.016±0.013** 中剂量组 0.018±0.011* 0.021±0.012** 0.020±0.015** 大剂量组 0.023±0.022* 0.018±0.012** 0.022±0.016** 组别 造模后时间 1 min 5 min 15 min 空白对照组 0.06±0.02 0.05±0.05 0.06±0.03 模型组 0.53±0.15△△△ 0.43±0.05△△△ 0.30±0.07△△△ 盐酸地尔硫卓组 0.58±0.13 0.41±0.04 0.34±0.05 小剂量组 0.52±0.16 0.42±0.15 0.35±0.15 中剂量组 0.57±0.18 0.43±0.13 0.34±0.09 大剂量组 0.73±0.11* 0.51±0.09 0.38±0.11 注:与空白对照组比较,△△P<0.01,△△△P<0.001;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01 舌下静脉注射垂体后叶素后,荜茇提取物小、中、大剂量组均有降低T波变化绝对值的作用;大剂量组除在个别时间点有降低心率的作用,其他各组在各时间点对心率变化百分率没有明显影响。表明荜茇提取物有良好的抗心肌缺血活性作用。
Determination and effect of five alkaloids from extracts of Piper longum on rats with experimental myocardial ischemia induced by injection of pituitrin
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202112011
- Received Date: 2021-12-05
- Rev Recd Date: 2022-05-29
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Key words:
- extracts of Piper longum /
- alkaloid /
- content determination /
- anti-myocardial ischemia
Abstract:
Citation: | YI Bowen, LIU Huining, ZHENG Rui, REN Jiawei, LIU Yang. Determination and effect of five alkaloids from extracts of Piper longum on rats with experimental myocardial ischemia induced by injection of pituitrin[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202112011 |