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复方羊蛇颗粒是复旦大学附属肿瘤医院治疗宫颈癌的特色制剂(批准文号:Z05170707)。该制剂系中西医结合科、妇科等老一辈专家治疗宫颈癌的经验之集成,在临床应用已有20余年。由白花蛇舌草、蜀羊泉、茜草、漏芦、当归、党参、白术(麸炒)等七味中药组成,以白花蛇舌草、蜀羊泉为君药,起清热解毒、消痛散结之功,缓解本病湿热毒邪之病机[1-2];以清热利湿,解毒消肿之功效的茜草、漏芦、当归为臣药,消除本病瘀毒内蕴之病因[3-5];伍用调和脾胃、调理脏腑功能的党参、白术为佐使药[6-7],起益气扶正之效。该方治疗宫颈癌效果显著,且具用药安全、服用方便、价格低廉等特点。但该医院制剂无明确的质控标准,限制了其临床应用。
为了对复方羊蛇颗粒进行规范化的新药临床前研究,本研究应用高效液相色谱仪建立了复方羊蛇颗粒中主要有效成分去乙酰车叶草酸甲酯(DME)和阿魏酸(FC)的含量测定方法,为复方羊蛇颗粒的质量控制提供新的定量指标。同时,在保留复方羊蛇颗粒原水提、醇沉工艺的基础上,采用星点设计-效应面法,以提取物的干浸膏得率及其有效成分DME、FC的含量为考察指标,对水提时的溶媒用量和提取时间以及醇沉时的乙醇浓度等因素进行优化,以提高复方羊蛇颗粒的质量和提取效率。
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按处方量称取白花蛇舌草、蜀羊泉、茜草、漏芦、当归、党参、白术(麸炒),取适量纯化水将处方药材煎煮2次,合并煎煮液并过滤,将滤液冷却至室温后,再加入适量的95%乙醇,于4 ℃条件下静置24 h,再次过滤,滤液通过减压浓缩法回收乙醇,经冷冻干燥处理,即得复方羊蛇颗粒提取物干浸膏[8]。浸膏得率按以下公式计算[9]:
式中:W1为干浸膏质量,W2为处方药材质量。
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色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:30 ºC;流动相: 0.05% 甲酸水溶液(A)−乙腈(B);流速:1.0 ml/min;检测波长:236 nm;进样量:20 μl。
洗脱梯度:0~6 min,2%~5% B;6~12 min,5% B;12~30 min,5%~15% B;30~45 min,15%~35% B;45~50 min,98% B;50~60 min,2% B。
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分别精密称取DME和FC对照品各10 mg,加甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中,得1 mg/ml的DME和1 mg/ml的FC储备液。分别精密量取DME和FC对照品储备液1 ml于10 ml量瓶中,加超纯水定容至刻度,配成100 μg/ml的混合对照品溶液。
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精密称取复方羊蛇颗粒干浸膏200 mg于10 ml量瓶中,加超纯水对其进行溶解并定容,经0.22 μm针式过滤器滤过后,配成浓度为20 mg/ml的供试品溶液。
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按复方羊蛇颗粒处方及干浸膏制备工艺,制备不含白花蛇舌草和当归的阴性样品,并按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液。
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取混合对照品溶液加超纯水配置成10 μg/ml的对照品工作液,并取供试品溶液和阴性对照溶液,按“2.2.1”项下色谱条件测定,对各溶液中的DME和FC的出峰情况进行考察,色谱图如图1所示。结果显示,混合对照品溶液和供试品溶液中DME和FC色谱峰的保留时间分别在17 min和38 min左右;而阴性对照溶液在此保留时间处无明显干扰色谱峰,结果表明,该色谱条件的专属性较强。
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精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液,加超纯水逐级稀释成为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/ml的系列浓度溶液。采用高效液相色谱仪,检测并记录不同药物浓度的色谱峰,以药物浓度(X)为横坐标,以色谱吸收峰面积(Y)为纵坐标,进行线性回归。经计算,DME的线性方程为Y=25.513X–3.1431 (r>0.9995),FC的线性方程为Y=61.035X–13.494(r>0.9995)。结果显示DME和FC在浓度为0.2~100.0 μg/ml内,药物浓度和吸收峰面积的线性关系良好。
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按“2.2.1”项下色谱条件,采用浓度为1.0、10.0和50.0 μg/ml 的混合对照品溶液对高效液相色谱仪的精密度进行考察,一天内对每种溶液测定6次,连续测3天,并记录峰面积。3种不同浓度的DME和FC的日内、日间精密度的RSD皆<3%,表明精密度良好。
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按上述方法配制浓度为20 mg/ml的供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件,分别测定该溶液于室温下放置0、2、4、6、12、24 h后的色谱峰面积。经计算,24 h内,DME吸收峰面积的RSD为1.92%,FC吸收峰面积的RSD为2.74%,结果表明配制的供试品溶液在24 h内保持稳定。
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按照供试品溶液制备方法,平行制备6份供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件,取20 μl连续进样6次,并记录峰面积。DME吸收峰面积的RSD值为2.24 %,FC吸收峰面积的RSD值为2.97 %,结果表明该方法的重复性良好。
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精密量取上述配制的供试品溶液1 ml置于2 ml量瓶中,并分别加入DME对照品储备液10、20和30 μl和FC对照品储备液5、10、15 μl,溶解、过滤后。按“2.2.1”项下色谱条件进样分析,考察采用该色谱条件检测DME和FC的加样回收率。经计算得到DME低、中、高浓度的加样回收率分别为(97.76±0.28)%、(98.95±1.85)%和(102.11±0.39)%;FC低、中、高浓度的加样回收率分别为(102.66±2.95)%、(99.28±1.93)%和(102.41±2.69)%。结果表明该测定方法准确性好,可用于样品中DME和FC的含量测定。
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取供试品溶液,稀释至适当浓度后,按“2.2.1”项下色谱条件测定DME和FC的峰面积,根据线性方程,计算供试品中代表性活性成分的含量。
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以复方羊蛇颗粒处方药材的干浸膏得率、DME和FC的含量作为指标,采用Design-Expert软件(10.0.14)进行星点设计—效应面法优化[10],考察提取时的溶媒用量(x1)、提取时间(x2)和醇沉浓度(x3)等因素对提取的影响,优选出最佳提取工艺,3因素5水平的因素水平见表1。
水平 溶媒用量(x1) 提取时间(x2) 醇沉浓度(x3) −1.682 6.64 39.55 53.18 −1 8 60 60 0 10 90 70 1 12 120 80 1.682 13.36 140.45 86.82 -
按上述3因素5水平制备不同提取工艺的供试品, 以“2.2.11 ”项下样品含量测定方法测定DME和FC含量。以DME含量、FC含量、干浸膏得率的总评“归一值”(OD)作为评价指标。通过Hassan法对各指标进行归一化处理,计算公式如(1、2)所示,并按照公式(3)计算各指标“归一值”的几何平均数,得总评“归一值” [11-12]。
式中:dmin为取值越小越好的指标(干浸膏得率)的数学转化“归一值”,dmax为取值越大越好的指标(DME和FC含量)的数学转化“归一值”,yi为该次提取的实测值,ymax、ymin分别为各指标在优化实验中的最大值和最小值;OD为总评“归一值”,d1、d2、d3分别为DME含量、FC含量和干浸膏得率的“归一值”。
复方羊蛇颗粒提取工艺优化的星点设计表及“总评归一值”结果见表2。
试验号 x1 x2 x3 DME含量(μg/g) FC含量(μg/g) 浸膏得率(%) OD 1 10 90 70 0.03 0.01 25.24 0.58 2 8 120 60 0.04 0.01 33.22 0.33 3 10 90 70 0.03 0.01 24.97 0.59 4 10 90 70 0.03 0.01 26.37 0.50 5 10 39.55 70 0.03 0.01 24.34 0.50 6 13.36 90 70 0.03 0.01 29.25 0.40 7 10 90 53.18 0.03 0.01 31.07 0.31 8 12 120 60 0.04 0.01 34.12 0.00 9 10 90 70 0.03 0.01 26.01 0.57 10 8 120 80 0.03 0.01 21.12 0.25 11 10 90 70 0.03 0.01 27.79 0.55 12 12 120 80 0.03 0.01 24.12 0.49 13 8 60 80 0.03 0.01 21.98 0.25 14 8 60 60 0.03 0.01 26.52 0.00 15 10 90 70 0.03 0.01 26.27 0.56 16 10 140.45 70 0.03 0.01 28.41 0.49 17 12 60 60 0.03 0.01 29.71 0.49 18 12 60 80 0.03 0.01 23.60 0.69 19 10 90 86.82 0.03 0.01 18.64 0.00 20 6.64 90 70 0.03 0.01 24.59 0.31 采用Design Expert 10.0.14对提取优化的实验数据进行分析,模型预测及其缺适性检验结果如表3所示,结果表明二项式模型具有更好的预测性,并对其进行进一步回归分析及方程拟合,表4结果显示,模型P值为0.0433(<0.05),表明建立的二项式模型具有显著性。提取时的溶媒用量、提取时间和醇沉浓度的交互作用对复方羊蛇颗粒提取“总评归一值(OD)”的三维效应面和二维等高线如图2所示。预测的最佳提取条件为:提取的溶媒用量为处方药材量的12倍,醇沉浓度为73%,提取时间为每次60 min。预测OD值为0.703。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 线性项 0.72 11 0.066 64.28 >0.0001 2因子交互项 0.56 8 0.070 68.40 >0.0001 二项式项 0.21 5 0.042 40.61 >0.0005 三项式项 1.984×10−4 1 1.984×10−4 0.19 0.6781 参数 自由度 方程系数 F值 P值 模型 9 0.068 3.17 0.0433 x1 1 0.073 3.43 0.0939 x2 1 0.010 0.48 0.5046 x3 1 8.57×10−3 0.40 0.5400 x1 x2 1 0.13 6.03 0.0340 x1 x3 1 0.035 1.65 0.2277 x2 x3 1 1.602×10−4 7.52×10−3 0.9326 x12 1 0.078 3.68 0.0840 x22 1 8.533×10−3 0.40 0.5409 x32 1 0.30 14.12 0.0037 -
称取处方量药材3份,对上述星点设计-效应面法优化的最佳提取工艺进行验证:加入处方药材质量的12倍蒸馏水煎煮2次,每次60 min,合并、浓缩提取液,加95%乙醇适量,使乙醇浓度至73%,于4 ℃条件下静置24 h,除去沉淀、过滤,并回收乙醇。将得到的浸膏进行冷冻干燥,即得复方羊蛇颗粒提取物干浸膏。计算浸膏得率,按照“2.2.11”项下样品含量测定方法测定DME和FC的含量,并计算OD值,结果见表5。结果显示实测OD值与预测OD值的偏差为5.47%,表明建立的复方羊蛇颗粒的提取优选方案合理。
试验号 DME含量
(μg/g)FC含量
(μg/g)浸膏得率
(%)实测
OD值预测值 偏差
(%)1 0.03 0.01 18.54 0.68 0.703 5.47 2 0.03 0.01 18.37 0.77 3 0.03 0.01 18.55 0.78 RSD (%) 1.55 3.36 0.55 6.42
Optimization of extraction process of prescription medicinal materials of compound Yangshe granules
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202207103
- Received Date: 2022-07-28
- Rev Recd Date: 2023-03-11
- Publish Date: 2023-04-25
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Key words:
- compound Yangshe granule /
- quantitative analysis /
- extraction process /
- central composite design-response surface methodology
Abstract:
Citation: | YU Jianchao, MA Chao, WANG Mengmeng, LI Dan, LIU Rongmei, LIU Jiyong. Optimization of extraction process of prescription medicinal materials of compound Yangshe granules[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(4): 240-244. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202207103 |