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肝纤维化(HF)是一种创伤愈合反应,其特征是细胞外基质(ECM)在肝内的过度沉积,导致肝功能丧失和肝脏结构破坏[1]。在正常肝脏中,肝星状细胞(HSC)是位于肝脏窦状隙的DISE腔内,负责储存维生素A。当肝脏受到损伤刺激时,HSC从静止状态转化为具有增殖、类维生素A消失、趋化性、收缩性、纤维生成等特性的肌成纤维细胞(MFs),参与肝纤维化进程[2-4]。
核糖体蛋白S5(RPS5)是核糖体40S小亚基的组成成分,是核糖体生物发生所必需的。越来越多的证据表明,一些核糖体蛋白除了参与蛋白质加工合成之外,还具有许多核糖体外功能[5-6]。例如,RPS5基因对于胚胎干细胞的分化和类胚体的形成至关重要[7];RPS5的β-发夹结构能够与HCV IRES相互作用,并介导HCV的翻译过程[8];RPS5在结肠癌中异常表达,并可能在癌变过程中作为检查点发挥重要作用[9]。此外,RPS5还参与小鼠红白血病细胞分化,其表达下调会影响细胞周期蛋白依赖激酶-2、-4和-6的蛋白水平,并延迟体外红细胞成熟,引起G1/G0细胞周期停滞[10-11]。
本课题组前期研究发现,在肝纤维化过程中,RPS5在静息和激活的HSC内存在差异表达[12-13]。体外实验证实RPS5参与HSC活化,体内研究表明,RPS5基因敲减可加重肝纤维化,RPS5过表达则减轻肝纤维化[13]。但是,我们并没有研究特异性敲减HSC内RPS5的表达对肝纤维化的影响[14-17]。为此,我们构建了GFa2(GFAP启动子)-驱动shRPS5腺病毒,并研究其靶向敲减HSC的RPS5表达对肝纤维化进展的影响。
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高糖DMEM培养基(Gibco);Western及IP细胞裂解液液(Beyotime);BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific);RPS5抗体(Santa Cruz)、ALB、GAPDH抗体(Cell Signaling Technology)、GFAP、α-SMA、胶原蛋白 I抗体(Abcam);山羊(多克隆)抗兔 IgG(H+L)、山羊(多克隆)抗小鼠 IgG(H+L)(LI-COR Biosciences);Odyssey成像系统(LI-COR Biotechnology);SYBR Premix Ex TaqTM PCR 试剂盒(Takara)。
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雄性Sprague-Dawley大鼠,清洁级,重约200 g,购于上海SLAC实验动物有限公司。
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原代HSC和肝细胞从雄性SD大鼠分离,通过蛋白酶-胶原酶消化,单步Nycodenz梯度纯化[13]。分离的HSC和肝细胞在含有10%胎牛血清(FBS)DMEM培养基,5% CO2、37 ℃培养箱中培养。每隔1天更换1次培养基。通过GFAP免疫染色评估,HSC的纯度为90%~95%。本实验于分离后第3天在转分化的HSC上进行。HSC以感染复数(MOI)50感染腺病毒48 h。
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根据AdEasy™ Adenoviral Vector System(AgilentStratagene, USA)的说明制备质粒 pShuttle-GFa2-shRPS5。将GFAP基因启动子(GFa2)、shRPS5序列和必需元件克隆到无启动子穿梭载体pShuttle中,穿梭载体pShuttle-GFa2驱动shRPS5的表达。重组AdGFa2-shRPS5和AdGFa2-shNC腺病毒在293细胞中扩增,通过氯化铯梯度超速离心纯化。使293细胞通过噬斑测定病毒原液的滴度。shRPS5和shNC序列见表1。
名称 序列 shRPS5 5′-GCTCATGACTGTACGAATTCTCGAGAATTCGTACAGTCAT GAGC-3′ shNC 5′-GCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAA GCGCGC-3′ -
将HSC细胞中的培养基吸弃,用PBS洗涤1次,加入Western及IP细胞裂解液冰上裂解20 min。通过BCA法测量蛋白浓度后将蛋白样品在95 ℃下加热5 min。制胶上样,将20 μg样品进行10% SDS-PAGE电泳,结束后将蛋白质转移到NC膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入RPS5、ALB、GAPDH、GFAP、α-SMA和I型胶原的单克隆抗体4 ℃孵育过夜,用PBST洗膜3次,每次10 min。山羊(多克隆)抗兔IgG(H+L)或山羊(多克隆)抗小鼠IgG(H+L)室温孵育2 h,PBST洗膜3次,每次10 min。Odyssey红外扫描成像系统对NC膜扫描,观察相关蛋白的表达情况。
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用Trizol试剂盒提取总RNA。用SYBR Premix Ex TaqTM PCR试剂盒,合成cDNA,定量PCR检测基因mRNA表达。以管家基因β-肌动蛋白(β-actin)作为内部对照,并将基因特异性mRNA表达与β-actin表达进行归一化。引物序列见表2。
名称 正向引物序列 反向引物序列 β-actin 5′-CCAT TGAACACGGCATTGTC-3′ 5′-TCATAGATGGGCACAC AGTG-3′ RPS5 5′-AAATGTGCAGGTGTTGACCA-3′ 5′-CACGCTCCTCCTGAAGAATC-3′ α-SMA 5′-CCGAGATCTCACCGACTACC-3′ 5′-TCCA GAGCGACATAGCACAG-3′ collagen I 5′-CCGTGACCTCAAGATG TGCC-3′ 5′-GCTCATACCTTCGCTT CCAA-3′ -
用二甲基亚硝胺(DMN)和胆管结扎术(BDL)的方法建立大鼠肝纤维化模型[13],尾静脉注射腺病毒(4×109pfu)特异性敲减肝内HSC的RPS5水平。
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肝组织切片HE染色分析病理改变情况;羟脯氨酸(羟脯氨酸检测试剂盒)含量测定、切片天狼星红和 Masson染色评价胶原沉积情况;免疫组织化学染色检测α-SMA和RPS5的表达情况。
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数据分析通过SPSS 21统计软件进行,采用t检验分析,实验结果用均数±标准差(
$\bar x $ ±s)表示。与对照组比较,P<0.05 则认为差异具有统计学意义。
Effects of specific knockdown of ribosomal protein S5 in hepatic stellate cells on liver fibrosis
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209007
- Received Date: 2022-09-04
- Rev Recd Date: 2023-01-30
- Publish Date: 2023-04-25
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Key words:
- ribosomal protein S5 /
- hepatic stellate cells /
- glial fibrillary acidic protein /
- HSC activation /
- hepatic fibrosis
Abstract:
Citation: | TANG Yuzhen, ZHANG Junping. Effects of specific knockdown of ribosomal protein S5 in hepatic stellate cells on liver fibrosis[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(4): 227-233. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209007 |