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设置口服(p.o.)给药3个单剂量组(30、60及150 mg/kg体重)和一个静脉(i.v.)给药(6 mg/kg体重)单剂量组。C57BL/6J小鼠246只,随机分组,每组动物数为6,雌雄各半。在动物房适应5 d后,开始动物试验。给药HMS-01前后,在异氟烷麻醉状态下眼窝静脉窦采血,每只小鼠每次采血量约50~75 μl左右(2~3小滴血),置0.2 ml肝素化离心管中。采血时间点安排为:0、0.083(仅静脉组)、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10及24 h。
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小鼠血浆样品(40 µl)加入804 µl特丁基甲醚(含91 nmol/L 的IS内标)进行液液萃取。经振摇(1 600 r/min,5 min)和离心(14 800 r/min,5 min)后吸取600 µl上清液至1.5 ml离心管中,在N2气下吹干(30 ℃加热),用120 µl乙腈复溶。经振摇(1 600 r/min,5 min)和离心(14 800 r/min,5 min)后取50 µl用于进样分析。
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色谱柱为 Gemini C18 (2.0 mm×50 mm, 5 μm),流动相:溶剂A:水(含 0.04‰甲酸+5 mmol/L甲酸铵),溶剂B:乙腈(含0.04‰甲酸),洗针液:乙腈。梯度洗脱,洗脱程序如下:0~2 min,90% A+10% B;2~6 min,5% A+95% B;6~8 min,90% A+10% B。流速:0.35 ml/min,柱温:25 ℃,进样量 5 μl,运行时间 8 min。
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离子源参数:离子源为涡轮喷射,气帘气压力为20 psi,毛细管电压为 5.5 kV,辅助加热气温度为500 ℃,雾化气压力为 40 psi,辅助加热气压力为60 psi。各化合物MRM参数见表1。
化合物 去簇电压(V) 母离子(Da) 子离子(Da) 碰撞能(V) 碰撞室出口电压(V) HMS-01 106 772.5 214.2 39 16 罗红霉素 111 837.5 158.1 45 14 -
内标工作溶液配制:精密称取HMS-01对照品2.634mg,置于1.5ml EP管中,加0.675ml乙腈溶解,摇匀,得浓度为5mmol/L对照品储备液,−70 ℃存储。同时,精密称取4.366 mg的罗红霉素,置于1.5ml EP管中,加1.04 ml乙腈溶解,摇匀,得浓度为5mmol/L内标储备液,−70 ℃存储。
标准曲线溶液制备和质控溶液制备:以乙腈为溶剂,将HMS-01储备液稀释至浓度为20 µmol/L的工作液A,再采用逐级稀释法配制浓度为78.13、156.3、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000 nmol/L的标准曲线工作液;再取各标准曲线工作液,以小鼠血浆为基质配制浓度为3.906 、7.81、15.6、31.25、62.5、125、250、500、1 000 nmol/L标准曲线溶液。随行质控溶液工作液HMS-01的低定量下限(LLOQ)为78.13nmol/L,其低、中、高浓度分别为160、1 600、16 000 nmol/L;质控样品LLOQ为3.906 nmol/L,低、中、高浓度分别为8、80、800 nmol/L。
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选择性考察:取6个不同来源的小鼠空白血浆以及空白血浆配制的定量下限(LLOQ)样品按照“2.2”项下操作, 考察6个不同个体的空白小鼠血浆在对照品和内标保留时间处是否有干扰。
残留考察:运行定量上限(ULOQ)样品后,运行1个双盲样品,按 “2.2” 项下操作,至少考察3次。
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以HMS-01与内标峰面积比分别对血浆样品中HMS-01的浓度进行线性回归(拟合方程Y=aX+b),并以浓度的倒数(1/X)为加权系数,求算回归方程。
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定量下限血浆样品处理按照“2.2”项下操作, 进行6样本分析, 连续测定3批次, 并根据当前批次标准曲线计算每一样本的测得浓度, 计算该浓度的日内和日间精密度和准确度。
低、中、高浓度QC样品 (血浆浓度均分别为8.00、80.0和800 nmol/L) 处理按照“2.2 ”项下操作, 每个浓度进行6样本分析, 分别在第2日、3日计算实际浓度,测定批内、批间的精密度和准确度。
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对6个批号的单个空白小鼠血浆样品进行处理,提取完成吹干后,在假定100%提取回收率的前提下,用含有低浓度(8 nmol/L)和高浓度(800 nmol/L)质控水平的HMS-01和内标(100 nmol/L)的复溶溶液复溶空白提取基质,测得的峰面积为Set1。
将包含低浓度(8 nmol/L)和高浓度(800 nmol/L)质控水平的HMS-01和内标(100 nmol/L)的复溶溶液,平行3份,测得的nmol/L峰面积为Set2。
基质效应(ME)= Set1/Set2×100%。
8、80、800 nmol/L的3个浓度的质控样品,按“2.2”项下方法处理后进样分析得待测物的峰面积为Set3,各浓度制备3个样品。
回收率(RE)= Set3/ average Set1×100%。
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处理样品过程中的短期稳定性:小鼠血浆样品加特丁基甲醚3 h后HMS-01的稳定性以3个LQC(8 nmol/L)、3个HQC(800 nmol/L)作为一套稳定性样品。3个LQC和3个HQC样品各取2 µl,加内标4 µl和特丁基甲醚800 µl后,再加入38 µl小鼠空白血浆,在室温下放置3 h后,按“2.2”中描述的方法进行分析以考察其稳定性。
进样器上短期稳定性:小鼠血浆样品中HMS-01的进样盘放置稳定性以6个LQC(8 nmol/L)、6个HQC(800nmol/L)作为一套稳定性样品,在首次分析后继续储存在进样板上(进样器温度为8 ºC),放置11 h后用新绘标准曲线计算质控样品的浓度。
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用小鼠血浆配制HMS-01浓度为50 µmol/L,按“2.2”项下方法进行样品前处理,乙腈复溶后得上清液备用。随后用乙腈(含91nmol/L的内标)溶液稀释该上清液,平行稀释6个样品,稀释倍数为100倍。
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使用AB公司的Analyst软件输出原始图谱、浓度、准确度等数据。利用 EXCEL计算均值,标准偏差,变异系数等参数。HMS-01药动学参数用InnaPhase Kinetica2000TM软件(美国)用非房室模型分析处理。
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采用Graphpad Prism 8 软件对数据进行处理和分析,结果以(均数±标准差)表示,采用t检验,P<0.05 认为差异有统计学意义,P<0.01 认为有极显著差异。
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结果表明,空白小鼠血浆中的内源性物质不干扰HMS-01的测定。空白样品、LLOQ样品和给药(i.v.,HMS-01 2 030 nmol/L;i.v.,内标100 nmol/L)0.5 h血浆样品中成分色谱见图1。在本试验条件下,残留的各待测物响应值低于其定量下限各待测物响应值 20%,说明残留效应对血浆中各待测物测定的影响可以忽略不计。
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测定小鼠血浆中HMS-01的线性范围为3.91~1 000 nmol/L。典型标准曲线回归方程为:Y = 0.021 5X + 0.007 56(r =0.999 5)。
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定量下限血浆样品(HMS-01)为3.91 nmol/L的日内精密度为3%,准确度为105.9%;日间精密度为8.5%,准确度为115.9%。HMS-01低、中、高质控样品的精密度和准确度如表2所示。均符合生物样品测定相关要求[8]。
浓度(nmol/L) 日内精密度 日间精密度 实测浓度(nmol/L) 精密度(%) 准确度(%) 实测浓度(nmol/L) 精密度(%) 准确度(%) 8 7.838 2.04 97.98 7.783 4.92 97.29 80 76.93 0.89 96.16 85.24 9.76 106.55 800 710.3 1.41 88.75 821.5 9.96 102.69 -
内标归一化基质效应因子(待测物面积比/内标面积比)为0.92~1.12,内标归一化基质效应因子精密度CV均小于15%,说明建立的样品处理条件下基本无基质干扰。小鼠血浆中HMS-01提取回收率为 81.7%~95.1%,内标回收率为 81.4%~93.9%。提取回收率的各浓度精密度CV均小于15%,符合生物样品提取要求。
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处理样品过程中的室温短期稳定性:各浓度的处理后样品平均实测浓度相对于理论浓度介于95.4%~109.1%。
处理后样品中HMS-01的稳定性:各浓度的处理后样品平均实测浓度相对于理论浓度介于87.4%~106.0%。
各浓度的处理后样品平均实测浓度相对于理论浓度均介于85%~115%,上述情况下待测物视为稳定。
稀释后准确度87.8%~111%,RSD 为8.5%表3,表明稀释可靠。
药代参数 i.v.(6 mg/kg) p.o(30 mg/kg) p.o(60 mg/kg) p.o(150 mg/kg) 雄小鼠组 雌小鼠组 雄小鼠组 雌小鼠组 雄小鼠组 雌小鼠组 雄小鼠组 雌小鼠组 Cmax(nmol) 3,910±254 3,700±184 2,420±728 3,207±704 3,770±939 4,337±536 7,933±2493 9,713±1,824 Tmax(h) − − 0.5±0 0.42±0.14 0.5±0 0.5±0 0.67±0.29 0.67±0.29 AUC0~24h (nmol·h) 1,919±79.1 1,914±142 4,566±656 6,233±733* 11,230±765 12,937±411* 23,320±4005 28,342±3300 AUC0~∞h(nmol·h) 1,923±78.1 1,917±142 4,638±654 6,301±722* 11,248±768 12,997±416* 23,346±3,999 28,375±3,289 t1/2 (h) 1.09±0.01 1.09±0.03 2.66±0.18 2.71±0.26 2.33±0.09 2.50±0.50 2.56±0.17 2.77±0.64 MRT (h) 2.07±1.35 1.86±0.75 2.82±0.26 2.41±0.21 2.96±0.15 3.09±0.49 3.42±0.30 3.32±0.16 CLtot,p
(L/(h·kg))2.75±0.10 2.85±0.31 − − − − − − VSS(L/kg) 5.62±3.48 5.17±1.64 − − − − − − F(%) − − 47.6±6.8 65.1±7.7* 58.5±4.0 67.6±2.1* 48.6±8.3 59.2±6.9 *P<0.05,与雄小鼠组比较 -
雌雄小鼠给药后不同时间点的血药浓度,相关平均时间-血药浓度曲线见图2。雌雄小鼠体内HMS-01暴露水平(AUC)分别与HMS-01剂量相关性分析结果见表3。小鼠药动学结果表明,HMS-01肠道吸收快,小鼠口服生物利用度中等(50%~70%)。HMS-01在小鼠体内的暴露水平 (AUC和cmax)随剂量的增加而增加,其中AUC随剂量的增加成线性相关。HMS-01静脉给药后,在小鼠体内的半衰期1 h左右;血浆清除率(CLtotal.p)为2.8 L/(h·kg),与小鼠肝血流量相当;表观分布容积(VSS)为5 L/kg,远大于小鼠总体液。雌雄小鼠30、60mg/kg经口服给药在AUC和F有显著差异(P<0.05),在cmax、 t1/2、CLtot,p、MRT、VSS等参数上接近,均无显著差异。
Pharmacokinetic study of HMS-01 in mice
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211015
- Received Date: 2022-11-07
- Rev Recd Date: 2023-02-20
- Publish Date: 2023-03-25
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Key words:
- HMS-01 /
- pharmacokinetics /
- mice /
- LC-MS/MS method
Abstract:
Citation: | SHI Xiaofei, CHEN Yi, XIANG Kefa, JING Kai, GAO Yue, LIU Xia. Pharmacokinetic study of HMS-01 in mice[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(3): 168-172, 191. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211015 |