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鸡骨草(Abri Herba)来源于豆科相思子属植物广州相思子(Abrus cantoniensis Hance),野生资源主要集中分布于岭南地区以及中南半岛等地,《中华人民共和国药典》(2020年版)[1]及部分地方中药材标准[2]、中药饮片炮制规范[3]等均有收录,药用具有利湿退黄、清热解毒、疏肝止痛之功,常用于湿热黄疸、胁肋不舒、胃脘胀痛、乳痈肿痛、急慢性肝炎、胆囊炎等。鸡骨草含有多种活性物质,包括皂苷类[4]、黄酮类、生物碱类[5]、多糖[6]、氨基酸[7]、挥发油及脂肪酸[8]等,如相思子皂苷Ⅰ、大豆皂苷、槐花皂苷、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、相思子碱、刺桐碱等。文献研究发现,鸡骨草具有促进伤口愈合[9]、抗菌[10]、抗病毒[11]、抗氧化[12]、抗肿瘤、免疫调节[13]、抗肝炎病毒[14]、降脂保肝[15-16]等作用,民间也常用鸡骨草制作药膳、凉茶,具有较高的食用价值。目前鸡骨草法定质量标准主要对鸡骨草性状、显微、薄层色谱法(TLC)鉴别相思子碱等项做了初步的质量控制,相思子碱能够较好地反应鸡骨草正品的特性,但是相思子碱在相思子属其他植物中亦有发现,专属性不强,目前市场上常见有相思子属毛相思子(Abrus mollis Hance)与其混淆应用。通过网络药理学[17]及分子对接技术[18]寻找适合鸡骨草质量控制的质量标志物(Q-marker)[19-20],建立符合鸡骨草药用活性特征的质量标准,能够更好地鉴定鸡骨草的质量及药用食用价值。
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检索中药网络药理学常用数据库与分析平台TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)等,结合鸡骨草主要活性化合物文献检索,根据OB值、OD值以及类药5原则等,获取鸡骨草中活性明确且具有成药性的化合物,再通过 Pubchem查询相关化合物Canonical SMILES 编号,输入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)获取化合物所对应的靶标蛋白的Uniprot ID。共选取Soyasaponin Bb、Kaikasaponin Ⅲ、Abrisapogenol A、Abrisapogenol D、Sophoradiol、Kudzusapogenol A、 Abrisaponin I、Abrine、Hypaphorine、Schaftoside、Isoschaftoside、butin等12种不同结构的化合物,筛选其药理活性作用靶点,筛去重复靶标,最终获得237个靶标,通过Cytoscape3.8.2软件构建“鸡骨草-成分-潜在靶点”可视化网络图(图1)。网络中包括250个节点和440条边,平均节点度值3.520。
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将“2.1.1”项下筛选所得靶标导入STRING 11.0 在线数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行PPI 网络分析。选择物种为“Homo sapiens”,蛋白交互参数评分值为“high confidence>0.9”,隐藏网络中无联系的节点,其余参数设置不变,获得化合物靶点PPI网络图(图2)。结果共获得237个节点,360条边,平均节点度为3.04,预期边数135,PPI富集P值<1.0e-16。再将PPI结果以TSV文本格式导入Cytoscape 3.8.2软件中,进行拓扑属性分析,选取亲密度、间隔度、自由度3个重要参数,共计筛选21个网络参数大于均值(0.322、9.662、5.180)的核心靶标(图3)。包括信号传导与转录激活因子3(STAT3)、基质金属蛋白酶2、9(MMP2、9)、蛋白激酶(AKT1)、表面活性蛋白C(SRC)、淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶(LCK)、雌激素受体alpha(ESRα)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARγ)、一氧化氮合酶2(NOS2)、缺氧诱导因子-1alpha(HIF1A)、生长因子受体结合蛋白2(GRB2)、双微体2蛋白(MDM2)、糖原合酶激酶3Β(GSK3B)、酪氨酸蛋白激酶受体B2(EPHB2)、α-突触核蛋白(SNCA)等靶标。
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应用metascape 数据库(https://metascape.org/gp/index.html)对21个主要潜在的靶点进行基因本体(GO)功能和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。其中,靶点经生物过程(BP)相关条目463 条,主要涉及细胞凋亡正调控(positive regulation of cell death)、蛋白质水解调控(regulation of proteolysis)、细胞对有机氮化合物的反应(cellular response to organonitrogen compound)、TGF-β响应(response to transforming growth factor-beta)等;细胞组分(CC)有34个条目,主要涉及复合物转录调节(transcription regulator complex)、谷氨酸突触(glutamatergic synapse)、细胞质核周区(perinuclear region of cytoplasm)等;分子功能(MF)有42个条目,主要涉及DNA-结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、转录因子结合(transcription factor binding)、蛋白质结构域特异性结合(protein domain specific binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、分子适配器活性(molecular adaptor activity)等,各选取显著性前10 条目展示(图4)。KEGG通路富集分析得到79个通路条目,选取显著性前20的条目通过桑基图呈现(图5)。Y轴为信号通路,X轴为该通路靶向基因占总基因的比率,气泡颜色表示该通路基因富集的显著性,气泡大小表示该通路的基因数量。其中AKT1、STAT3、HIF1A、GRB2、MMP9等主要靶点蛋白与松弛素信号通路(relaxin signaling pathway)、甲状腺激素信号通路(thyroid hormone signaling pathway)、B细胞受体信号通路(B cell receptor signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、ErbB信号途径(ErbB signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、JAK-STAT 信号通路(JAK-STAT signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)等具有较强的关联性。
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通过PubChem获取相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等化合物3D结构,根据自由度选取“成分-靶点-通路”网络中靠前的靶标,检索PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获得靶标蛋白结构,再将蛋白与化合物结构文件导入 pymol 软件进行去水、加氢、删除重复链等预处理,模拟化合物与靶标作用模式,计算结合能,结合能小于0表明可以自由结合,结果如表1、图6所示。
靶标 PDB ID 活性成分 结合能(kcal/mol) AKT1 4GAH 相思子碱 −4.67 刺桐碱 −4.34 夏佛塔苷 −2.98 STAT3 5AX3 相思子碱 −4.72 刺桐碱 −4.56 夏佛塔苷 −2.82 HIF1A 3OUI 相思子碱 −4.02 刺桐碱 −3.93 夏佛塔苷 −2.36 大豆皂苷Bb −0.27 GRB2 3IMD 相思子碱 −5.0 刺桐碱 −5.66 夏佛塔苷 −4.68 大豆皂苷Bb −2.46 MMP2 8H78 相思子碱 −7.21 刺桐碱 −7.02 夏佛塔苷 −5.83 大豆皂苷Bb −4.28 -
成分分析采用C18色谱柱(Thermo、Agilent、Diamonsil);流动相采用梯度洗脱,A相为乙腈,B相为0.2%甲酸溶液,梯度洗脱程序:0~10 min(5%~10%B);10~20 min(10%~12%B);20~30 min(12%~13%B);30~35 min(13%~14%B);35~40 min(14%~16%B);40~55 min(16%~18%B);55~60 min(18%~20%B);60~65 min(20%~22%B);65~70 min(22%~30%B);70~75 min(30%~40%B);75~80 min(40%~60%B);80~85 min(60%~75%B);85~95 min(75%~75%B)。柱温设置为25℃、30℃、35℃。流速:0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min。检测波长278 nm。进样量:10 μl。
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①对照品储备液的制备:精密称取相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品5~10 mg,分别置10 ml容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,制备对照品储备液。②供试品溶液的制备:精密称取样品粉末1 g置锥形瓶中,加甲醇50 ml,称定重量,加热回流提取2 h,取出,称定,补足损失的量,滤过,回收溶剂,残渣加甲醇5 ml使溶解,微孔滤膜过滤,制得供试品溶液。
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精密量取混合对照品溶液10 μl注入液相色谱仪,测定对照品保留时间及峰面积,平行测定5次,计算相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷保留时间及峰面积RSD,保留时间RSD分别为0.6%、0.7%、0.4%、0.3%,峰面积RSD均为0.3%(图7、表2)。
峰 名称 保留时间
(t/min)相对保留
时间精密度
RSD(%)峰1 相思子碱 18.058 1.00 0.6 峰2 刺桐碱 21.658 1.20 0.7 峰3 夏佛塔苷 42.865 2.37 0.4 峰4 异夏佛塔苷 47.433 2.63 0.3 -
取供试品JGC01-010按照2.3.2项下供试品溶液制备法制备供试品溶液,分别在0、2、4、12、24 h测定相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品保留时间,计算RSD,分别为0.09%、0.10%、0.05%、0.05%(表3)。
时间(t/h) 相思子碱 刺桐碱 夏佛塔苷 异夏佛塔苷 0 16.892 20.783 42.283 46.967 2 16.892 20.783 42.283 46.967 4 16.900 20.808 42.308 47.000 8 16.867 20.758 42.258 46.950 12 16.858 20.742 42.242 46.942 24 16.875 20.775 42.300 47.000 RSD(%) 0.09 0.10 0.05 0.05 -
测定13批样品,记录样品中相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷等色谱峰的保留时间及峰面积,并计算其相对保留时间及偏差(表4 )。根据出峰时间及样品化合物峰型特征分析,部分供试品中异夏佛塔苷未检测到或含量较低超出仪器检出范围,不具有共有峰特征。因此选择相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷等3种化合物的色谱峰作为特征峰,相对保留时间为1.00、1.21、2.39,可控制偏差范围±5%。参考《中华人民共和国药典》(2020年版)通则指导原则的有关规定,拟定供试品色谱中应呈现相思子碱、刺桐碱、夏佛塔苷3种化合物的特征峰,并应与对照品色谱峰保留时间相对应(图8)。
样品 相思子碱峰 刺桐碱峰 夏佛塔苷峰 异夏佛塔苷峰 保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间保留时间
(t/min)相对保
留时间对照品 18.058 1.00 21.658 1.20 42.865 2.37 47.433 2.63 JGC-01-001 17.717 1.00 21.175 1.20 42.400 2.39 46.767 2.64 JGC-01-002 17.733 1.00 21.183 1.19 42.200 2.38 46.917 2.65 JGC-01-003 18.025 1.00 21.658 1.20 42.900 2.38 − − JGC-01-004 18.033 1.00 21.683 1.20 43.950 2.44 47.483 2.63 JGC-01-006 18.183 1.00 21.408 1.18 42.700 2.35 47.542 2.61 JGC-01-007 17.967 1.00 21.675 1.21 42.933 2.39 − − JGC-01-010 16.881 1.00 20.775 1.22 42.279 2.49 47.000 2.78 JGC-03-004 17.650 1.00 21.225 1.20 42.475 2.41 − − JGC-03-012 17.833 1.00 21.350 1.20 42.325 2.37 48.392 2.71 JGC-04-003 17.000 1.00 21.575 1.27 42.175 2.48 47.083 2.77 JGC-04-004 17.475 1.00 21.500 1.23 42.417 2.43 45.683 2.61 JGC-04-006 17.975 1.00 22.650 1.26 42.417 2.36 − − JGC-04-007 17.892 1.00 21.400 1.20 42.708 2.39 47.067 2.63 平均值 17.720 1.00 21.481 1.21 42.606 2.40 47.104 2.67 RSD(%) 2.1 0.0 1.9 2.1 1.1 1.7 1.4 2.3 注:“-”为样品中未检测到相关色谱峰。 -
分别采用Thermo、Agilent、Diamonsil色谱柱考察色谱柱的影响;柱温在20℃、25℃、30℃考察柱温的影响;流速为0.8、1.0、1.2 ml/min考察流速的影响。根据测定数据分析,色谱柱、柱温、流速均对特征峰相对保留时间具有一定的影响,其中流速及色谱柱型号对峰3、峰4影响较大,各色谱峰的影响RSD小于5.0%,属于可接受的范围(表5)。
色谱条件 相对保留时间 峰1 峰2 峰3 峰4 色谱柱 Thermo 1.00 1.20 2.37 2.63 Agilent 1.00 1.22 2.54 2.93 Diamonsil 1.00 1.24 2.51 2.82 平均値 1.00 1.22 2.47 2.79 RSD(%) 0.00 1.30 3.00 4.40 柱温(℃) 25 1.00 1.20 2.34 2.60 30 1.00 1.20 2.37 2.63 35 1.00 1.19 2.34 2.64 平均値 1.00 1.20 2.35 2.62 RSD(%) 0.00 1.40 1.10 0.70 流速(ml/min) 0.8 1.00 1.20 2.37 2.63 1.0 1.00 1.20 2.53 2.85 1.2 1.00 1.19 2.66 3.08 平均値 1.00 1.20 2.52 2.85 RSD(%) 0.00 0.40 4.70 6.40
Prediction of characteristic chromatogram for Abri Herba based on network pharmacology and molecular docking
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202303048
- Received Date: 2023-03-31
- Rev Recd Date: 2023-11-04
- Available Online: 2024-08-22
- Publish Date: 2024-08-25
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Key words:
- Abri Herba /
- network pharmacology /
- Q-markers /
- characteristic chromatogram
Abstract:
Citation: | ZHANG Chengzhong, ZHU Xueyan, BU Qitao, WANG Hongrui, HUANG Baokang. Prediction of characteristic chromatogram for Abri Herba based on network pharmacology and molecular docking[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(8): 350-358. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202303048 |