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随着唑类抗真菌药物的长期广泛使用,真菌耐药的问题更加凸显[1]。目前,临床上从患者体内分离出的真菌以念珠菌为主,而其中白念珠菌占比40%以上[2]。然而,抗真菌药物极为有限,迫切需要研发新的抗真菌药物。
近年来,靶向于真菌线粒体的药物是抗真菌药物研究的重要方向,如正在开展临床研究的F901318、聚酮类化合物Ilicicolin-H等 [3-4]。课题组前期在靶向线粒体的药物研究中发现,亲脂性吡啶鎓盐可以破坏白念珠菌的线粒体功能,发挥抗真菌作用,其中带正电荷的吡啶鎓结构是其抗真菌活性的关键[5-6]。为了进一步筛选通过阳离子靶向线粒体的新骨架类型的化合物,我们从国外ChemDiv化合物库,筛选了具有吡啶鎓结构的化合物,考察其抗真菌活性。其中N1~N9是已知化合物,但此前并未有该类化合物应用于抗真菌领域的相关报道。本文通过研究其体外抗真菌效果,探讨其作为抗真菌先导化合物。
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在RPMI 1640培养液中,采用临床分离的氟康唑耐药白念珠菌103和538(氟康唑单用时,MIC80>32 μg/ml),考察N系列化合物的抗真菌活性。通过对N系列化合物9种衍生物的体外抗真菌活性研究发现,N系列化合物中N2、N6和N8单用对白念珠菌均有一定的抗真菌活性,而N2化合物的MIC最低,为0.5 μg/ml和1 μg/ml,抗真菌作用显著,这些结果表明吡啶鎓类化合物具有体外抗真菌活性,后续可以通过结构改造进一步获得活性更高的类似物开展深入研究。结果见表1。
化合物 结构式 白念珠菌103 MIC80 (μg/ml) 白念珠菌538 MIC80 (μg/ml) N1 >16 >16 N2 0.5 1 N3 >16 16 N4 >16 >16 N5 >16 >16 N6 8 8 N7 >16 >16 N8 16 8 N9 >16 >16 -
通过对N1-N9化合物的初步筛选,发现N2的抗真菌活性最强。因此,我们选定N2进行了抗真菌谱的考察。为探究临床常见致病真菌对N2化合物的敏感性,选用国际标准菌C. albicans SC 5314以及9种氟康唑耐药的白念珠菌(C. albicans 876、C. albicans 311、C. albicans 538、C. albicans 103、C. albicans 911、C. albicans 849、C. albicans 100、C. albicans 32、C. albicans 1010)、隐球菌(Cryptococcus H99、Cryptococcus 32609)、光滑念珠菌C. glabrata 537、热带念珠菌C. tropicalist 293、近平滑念珠菌C. parapsilosis 22019、克柔念珠菌C. krusei 463,用微量液基稀释法测定了这些菌株对应的MIC80值。通过不同菌株对应的MIC80值可以发现,N2化合物对这些临床上常见的致病真菌均起到了明显的抑制作用,结果见表2,这些结果表明吡啶鎓类化合物N2具有广谱的抗真菌活性,对于临床常见的具有致病性的酵母菌均有较强的体外抗真菌活性。
菌株名称 N2 MIC80(μg/ml) C. albicans SC5314 0.5 C. albicans 876 1.0 C. albicans 311 0.5 C. albicans 538 1.0 C. albicans 103 0.5 C. albicans 911 0.5 C. albicans 849 1.0 C. albicans 100 1.0 C. albicans 32 0.5 C. albicans 1010 1.0 Cryptococcus H99 1.0 Cryptococcus 30609 2.0 C. glabrata 537 0.5 C. tropicalis 293 0.5 C. parapsilosis 22019 0.5 C. krusei 463 2.0 -
通过纸片扩散法,我们以氟康唑为对照探究了N2化合物的抑菌效果。结果显示,相同剂量下,N2化合物和氟康唑均可在培养皿上形成圆形抑菌圈,直径随药量增加而增大。N2化合物处理组抑菌圈内无散在菌落,边界清晰,在培养皿上形成的抑菌圈直径明显大于氟康唑处理组。据此,我们可以认为N2化合物体外抑菌效果优于氟康唑。N2化合物处理组内部无克隆生长提示N2化合物可能具有一定的杀菌能力而不仅仅是抑制作用,结果如图1。
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为了进一步考察N2对白念珠菌的抑制作用,测定了N2抑制白念珠菌的时间-生长曲线。A值(600 nm)反映了白念珠菌的生长情况,通过不同时间点的测定发现,浓度为2 μg/ml时,N2对白念珠菌的生长增殖有明显的抑制作用(P<0.05),白念珠菌在12 h内,A值(600 nm)的值几乎没有升高,而在24 h时,A值(600 nm)的值仍显著低于未加药组。当N2的浓度增加至4 μg/ml时,白念珠菌在24 h内几乎不能增殖,A值(600 nm)与起始的测定值相当,结果如图2。上述结果表明,化合物N2具有明显的抑制真菌增殖的作用。
为明确化合物N2是否有杀菌功效,我们使用N2化合物处理白念珠菌后,进行涂板培养。测定了0、3、6、9、12、24 h培养基内存活的菌落数。通过测定N2化合物浓度为0、2、4、8 μg/ml时对应的时间-杀菌曲线,发现N2浓度为8 μg/ml时,可以显著降低培养基中白念珠菌的数量,显示出明显的杀菌活性。当N2浓度为2 μg/ml时,白念珠菌3 h时数量减少,而后续数量会增加,提示2 μg/ml 的N2基本不能杀灭培养基中的白念珠菌,结果如图3。上述结果表明,白念珠菌在低浓度时发挥抑菌活性,而当浓度升高时,展现出杀菌活性。
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酵母态向菌丝态的转换是白念珠菌在体内发生侵袭的重要过程。为了考察N2对白念珠菌菌丝形成的抑制作用,我们采用了不同的菌丝诱导模型考察化合物N2对白念珠菌菌丝形成的作用。结果显示,37 ℃条件下,无论在菌丝诱导培养基YPD+FBS%或RPMI 1640培养基中,当N2的浓度高于1 μg/ml时,白念珠菌基本维持在酵母态,菌丝形成被完全抑制,结果如图4。同时,化合物N2的菌丝抑制的浓度与表2中检测的MIC80值相当,这一结果表明,化合物N2在1 μg/ml以上的浓度时,可以同时抑制菌丝形成和白念珠菌增殖。
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采用XTT法考察了化合物N2对白念珠菌被膜形成的抑制作用。结果显示,在RPMI 1640培养基中,4 μg/ml和8 μg/ml的N2可以抑制约50%的被膜形成,而当浓度继续升高至16 μg/ml或32 μg/ml时,N2对被膜的抑制率到达70%左右,结果如图5。上述结果表明化合物N2可以显著抑制白念珠菌的被膜形成,后续的结构改造和深入研究可以为抗被膜形成药物的研发提供新的方向。
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通过对比N2化合物处理组和对照组白念珠菌的电镜照片,结果如图6,我们发现:N2处理后,白念珠菌的表面绒毛状明显增厚,细胞壁分布不均,细胞膜内层变薄,由此推断可能是几丁质和β-1,3-葡聚糖变少。因此,N2化合物可能主要通过损伤白念珠菌细胞膜和细胞壁发挥杀真菌作用。
Investigation on the antifungal activity of pyranium derivatives N2
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305035
- Received Date: 2023-05-20
- Rev Recd Date: 2023-09-21
- Available Online: 2023-10-23
- Publish Date: 2023-10-25
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Key words:
- N2 compound /
- antifungal activity /
- Candida albicans /
- hyphae formation
Abstract:
Citation: | DENG Zhongyu, GUO Shijin, GUO Yifan, FENG Juncheng, LV Quanzhen, QIU Lijuan. Investigation on the antifungal activity of pyranium derivatives N2[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(10): 610-615. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305035 |