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传统中药黄芪可补益肝气、活血利水,对各种慢性肝病均具有治疗作用[1],其有效成分包括黄芪皂苷类、黄芪多糖类、黄芪黄酮类等。其中,黄芪甲苷(AS-Ⅳ)作为《中国药典》规定的中药黄芪的质控标准,是中药黄芪的主要活性成分,具有抗炎、降糖调脂、抗纤维化等作用[2],已被证实能改善实验性非酒精性脂肪肝[3]。但黄芪甲苷水溶性差、生物利用度低等特点限制了其临床应用前景。本课题组研究人员前期通过对黄芪甲苷进行结构优化改造,提高化合物溶解性,改善药物动力学性质,筛选到水溶性好、成药性佳的小分子化合物HHQ16[4],具有良好的新药研发前景。
ORM (Orosomucoid)是一种主要由肝脏合成分泌的急性期蛋白,在血清、肝脏及其他外周组织以ORM1亚型表达为主。ORM具有运载药物、免疫调节等多种生物学功能,近年来,其在代谢性疾病中的作用受到越来越多的关注[5]。本课题组研究人员前期研究发现,ORM是一个新的内源性能量调控蛋白,ORM1缺失可导致小鼠肝脏脂质沉积[6]。Zhou等也发现,ORM2可以抑制脂质从头合成,改善肝脏的脂代谢[7]。这些研究都提示ORM可成为治疗肝脏脂代谢相关疾病的潜在靶标。
本研究中采用游离脂肪酸(FFA)诱导肝细胞脂质损伤模型,探讨全新小分子化合物HHQ 16对肝细胞脂质沉积的改善作用及对ORM信号的调控作用。
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油红O(0684,Amresco)、棕榈酸钠(Macklin)、油酸(Sigma)、牛血清白蛋白(Sigma)、异丙醇(80109218,国药集团)、α1 酸性糖蛋白抗体(Genway Biotech Inc.)、GAPDH 抗体(Affinity)、Tubulin 抗体(Affinity)、抗兔 IgG 抗体(Rockland)、油红O染色试剂盒(Solarbio)、细胞及组织总蛋白抽提试剂盒(数谱生物)、NC 膜(GE Amersham)、NC 膜平衡液(VisualProtein)、封闭液(VisualProtein)、蛋白酶抑制剂三联装(上海碧云天生物有限公司)、蛋白质预染色标记(上海碧云天生物有限公司)。
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酶标检测仪(Epoch BioTeK)、涡旋混合器(MX-F Servicebio)、台式高速冷冻离心机(D3024R,大龙)、蛋白电泳仪(Bio-Rad Laboratories,Inc)、蛋白快速湿转仪(GenScript,Inc.)、荧光扫描仪(Li-COR Biosciences)、制冰机(Scotsman Industries Inc.)、电热恒温水浴锅 SVT3100(杭州瑞城仪器有限公司)、PCR 扩增仪(Thermo Fisher Scientific)、QuantStudio 3 实时荧光定量PCR仪(ABI)。
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小鼠肝细系 AML12,购自中国科学院细胞库。培养液配方:DMEM/F-12 (1∶1)、FBS(Fetal bovine serum)、1‰ ITS 液体补充剂、1‰双抗生素。培养条件:5%CO2、37 ℃恒温孵育箱。
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1%BSA配制:100 mg 牛血清白蛋白(BSA)加入10 ml双蒸水,振荡混匀,4 ℃保存备用;12 mmol/L油酸(OA)储备液(12.976 mg)加入5 ml 1% BSA 溶液中,振荡混匀,0.22 μm微孔滤膜进行滤菌处理,4 ℃保存;6 mmol/L 棕榈酸钠(PA)储备液(8.352 mg)加入5 ml 1% BSA溶液,60 ℃水浴加热混匀至无沉淀析出,0.22 μm微孔滤膜进行滤菌处理,4 ℃保存,冷却之后出现沉淀为正常形象,不高于 60 ℃水浴加热后可继续使用。接种细胞:将 AML12小鼠肝细胞接种于6孔板,密度约为106 个/孔,每组复孔为3,在 37 ℃、5%CO2 恒温培养箱培养。细胞造模:弃去完全培养基,按照OA∶PA=800 μmol/L∶400 μmol/L 的比例,用无血清培养基稀释药物储备液(即配即用),刺激细胞 24 h,构建 FFA 脂质沉积模型;同样按照OA∶PA=1 000 μmol/L∶500 μmol/L 的比例刺激细胞 24 h,构建 FFA 脂质损伤模型。在药物处理前,更换含PA、OA的无血清培养基,用于后续实验。
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用PBS漂洗AML12细胞2次后,提取细胞总蛋白,参照碧云天BCA(Bicinchoninic Acid Assay)蛋白浓度测定试剂盒说明书测量蛋白浓度,加入1/4体积的5X蛋白上样缓冲液,沸水煮10 min,按20 ng蛋白/孔上样电泳,转膜,封闭1 h,一抗ORM(1∶1 000),GAPDH(1∶5 000),Tubulin(1∶5 000)4 ℃孵育过夜,二抗(1∶10 000)37 ℃孵育1 h。ECL法显色曝光,使用ImageJ图像分析软件测定蛋白灰度值。
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接种细胞:将AML12 接种于 96 孔板,密度约 104个/孔,每组复孔为 6。药物刺激:弃去培养基,用无血清的培养基加不同浓度 FFA(OA∶PA=2∶1)刺激细胞 24 h 后,在原培养基里加入浓度为 1 μmol/L 黄芪甲苷衍生物 HHQ16 刺激 12 h。CCK8 检测:弃去培养基,每孔加 100 μl 无血清培养基,快速加入 10 μl CCK8 (Cell Counting Kit-8)溶液,勿产生气泡,放入培养箱孵育 15、30、60、120 min。吸光度测定:在上述时间点测定 450 nm 处A值,根据不同组之间的A值计算组间差异。
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采用AG RNAex Pro RNA 提取试剂(艾科瑞生物,中国),按照说明书提取小鼠肝脏和小鼠肝细胞(AML12)的RNA,随后采用Evo M-MLV 反转录试剂盒(艾科瑞生物,中国)将RNA逆转录为cDNA,逆转录反应条件如下:37 ℃ 15 分钟、85 ℃ 5 秒、4 ℃ ∞。以GAPDH为内参,采用实时荧光定量 PCR 方法对目的基因进行定量分析,通过 2−△△Ct 计算目的基因在不同组别之间的表达差异。反应条件如下,保持阶段 ,95 ℃ 10 分钟 ;循环阶段 ,95 ℃ 15 秒 (40 个循环) ,60 ℃ 1 分钟 ;熔化曲线阶段, 95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。引物序列见表1。
基因 上游序列(5'—3') 下游序列(5'—3') ORM1 ACACAATAGAGCTTCGGGAGT ATATCTGGCCTTTTGGCATAGA GAPDH CCAATGCACCACTGCTTAG GGATGCAGGGATGATGTTCT -
样品前处理:直接在培养板中裂解细胞,按100 μl/106 加入裂解液,混匀后静置 10 min,取适量上清液,70 ℃加热 10 min,室温 2 000 r/min离心5 min,上清液直接用于酶学测定,余下裂解液参照 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量或−20 ℃保存备用。
样品测定:选取96孔板,分为样品孔、标准孔和空白孔,每孔分别加入10 μl待测样品、标准品及蒸馏水,再加入190 μl工作液,37 ℃或 25 ℃反应 15 min,反应平衡后在60 min内稳定,根据吸光度值计算待测样本甘油三酯浓度。
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移除细胞培养基后,用PBS洗涤两次后,加油红O固定液固定20~30 min。弃去固定液,用蒸馏水洗涤2次,加入60%异丙醇浸洗20~30 s。弃去60%异丙醇后加入新配置好的油红O染色液,浸染10~20 min。弃去染色液,60%异丙醇漂洗20~30 s至间质清晰,水洗2~5次,直至无多余染液。加入Mayer苏木素染色液,复染核1~2 min,弃去染液后水洗2~5次,加入油红O缓冲液孵育1 min,弃去。加入蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下观察。采用 ImageJ软件对免疫组化阳性细胞占区域面积比进行统计并分析数据。
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ORM1基因的siRNA由广州锐博生物技术有限公司构建,序列见表2。
siRNA 序列 siORM1-1 GCAGGCAATTCAAACAATG siORM1-2 CAACTTCACCATAGGCGAA siORM1-3 CCACCAACTTGATAAACGA 接种细胞:AML12细胞接种于12孔板,密度约 106个/孔,每组复孔为3。
siRNA 孵育液配置:采用Polyplus Transfection公司INTERFERin转染试剂,以12孔板为例,取1 μl siRNA溶液,加入200 μl DMEM/F12培养基,混匀离心,再加入5 μl INTERFERin 转染试剂,再次混匀离心,室温孵育10 min。
转染:更换原培养基为含1% FBS的完全培养基,每孔加入siRNA 孵育液200 μl,48 h后收集细胞总蛋白、总RNA。
验证:根据蛋白和基因水平确定最佳干扰序列。
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本实验采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据统计与分析。单因素两组之间相互比较,采用student t检验分析;单因素多组之间相互比较,采用单向方差分析 one way ANOVA 检验;组间均值两两比较采用 Dunnett’s multiple comparisons test 检验。实验结果均采用(均数±标准误)表示。 若P<0.05 ,则认为差异具有统计学意义。
Upregulation of α1-acidglycoprotein to ameliorate hepatocyte lipid accumulation by Astragaloside derivative HHQ16
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202309026
- Received Date: 2023-09-14
- Rev Recd Date: 2024-02-17
- Available Online: 2024-04-24
- Publish Date: 2024-04-25
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Key words:
- HHQ16 /
- ORM /
- hepatocyte /
- lipid accumulation
Abstract:
Citation: | LI Xiang, DAI Xianmin, LIU Xia, SUN Yang. Upregulation of α1-acidglycoprotein to ameliorate hepatocyte lipid accumulation by Astragaloside derivative HHQ16[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(4): 141-146. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202309026 |