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AML12小鼠正常肝细胞、HEK-293T上皮细胞、载体pGL4.20[luc2/Puro] 与pHBLV-CMV-MCS-EF1-puro、慢病毒包装辅助质粒pMD2.G和psPAX2均为实验室保存;DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司);ORM1 启动子基因序列来自NCBI数据库(NC_000070.7)。
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Veriti™ 96 孔快速热循环仪(Thermo Fisher Scientific公司,美国);移液器、低温高速台式离心机(EPPENDORF公司,德国);电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司);琼脂糖凝胶电泳仪、多功能水平电泳槽(上海天能科技有限公司);电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司);倒置生物显微镜(重庆光电仪器总公司);全波长多功能酶标仪(BMG,德国)。
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PCR引物和基因合成(生工生物工程股份有限公司);RNA提取试剂盒RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);限制性内切酶KpnI、限制性内切酶Hind Ⅲ、限制性内切酶AgeI、限制性内切酶ApaI、限制性内切酶ClaI、限制性内切酶BamHI、转染试剂Lipofectamine 3000试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司,美国);高保真聚合酶phanta Max-Super-Fidlity DNA polymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);PCR试剂盒2X Pro Taq 预混液、反转录试剂盒Evo M-MLV 反转录试剂预混液、SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司);琼脂糖凝胶 DNA 纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司);HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒(汉恒生物科技有限公司);转染试剂polybrene(Sigma,美国);Firefly-Glo萤光素酶报告基因检测试剂盒(大连美仑生物技术有限公司);FDA 上市药物库(陶术生物科技有限公司);测序由赛业生物科技有限公司完成。
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提取小鼠新鲜的肝组织,使用RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒提取总RNA,反转录为cDNA,用作PCR模板,保存于−20 ℃冰箱。
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根据同源重组引物设计原则和参考小鼠ORM1(NC_000070.7)基因组序列设计引物(选取起始位点上游2 000个碱基对),采用同源重组法设计引物,上游引物加入KpnI酶切位点,下游引物加入Hind Ⅲ酶切位点,引物序列见表1。产物进行琼脂糖凝胶电泳,使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因。
引物名称 引物序列(5′—3′) ORM1-F GGGGTACCGTTCTCAGCATGTTGCATAAAT ORM1-R CCAAGCTTGCTGAGGGCACTCAGAGC 注:F: 正向引物; R: 反向引物。 -
将PCR产物与载体质粒pGL4.20 [luc2 Puro](插入位点选择AgeI与ApaI)于37 ℃双酶切5 h,用同源重组酶将目的片段与载体质粒连接。使用DH5α感受态细胞将重组质粒进行转化后,接种于含有嘌呤霉素抗性的固体平板,用涂布器将重组质粒涂抹均匀,倒置37 ℃恒温箱培养12~16 h。将筛选出来的阳性克隆进行测序,随后进行菌液扩增和质粒抽提纯化。对提取的质粒进行浓度检测和A260/280检测,把质粒保存于−20 ℃冰箱。构建成功的重组载体命名为 pGL4.20-ORM1 启动子。根据Lipofectamine 3000试剂盒说明书,分别将pGL4.20-ORM1 启动子和pGL4.20转染至AML12小鼠正常肝细胞中,使用地塞米松(DXMS)来验证报告基因的有效性和可行性。
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以pGL4.20-ORM1 启动子重组质粒为模板,设计引物,引物序列见表2。产物进行琼脂糖凝胶电泳,使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因。
引物名称 引物序列(5′—3′) LV-ORM1
启动子-LUC-PURO-FGGACAGCAGAGATCCAGTTTATCGATGTTCTCAGCATGTTGCATAAATT LV-ORM1
启动子-LUC-PURO-RGAGCGATCGCAGATCCTTAGGATCCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTT 注:F: 正向引物; R: 反向引物。 将PCR产物与载体质粒pHBLV-CMV-MCS-EF1-PURO(插入位点选择ClaI与BamHI)于37 ℃双酶切5 h,用同源重组酶将目的片段与载体质粒连接。使用DH5α感受态细胞将重组质粒进行转化后,接种于含有嘌呤霉素抗性的固体平板,用涂布器将重组质粒涂抹均匀,倒置37 ℃恒温箱培养12~16 h。将筛选出来的阳性克隆,送赛业生物科技有限公司进行测序。测序成功之后,进行菌液扩增和质粒抽提纯化。对提取的质粒进行浓度检测和A260/280检测,把质粒保存于−20 ℃冰箱。构建成功的重组载体命名为LV-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法构建LV-LUC-PURO作为对照载体。
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提前传代HEK-293T细胞用于转染,将慢病毒包装辅助质粒pMD2.G 10 μg、psPAX2 5 μg和LV-ORM1 启动子-LUC-PURO 10 μg以及转染试剂75 µl混匀后静置,在室温下温育15 min后缓慢滴加至293T细胞中,于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。转染后16 h更换含10 % 胎牛血清 FBS的新鲜完全培养基。转染后 48 h和72 h,分别收集两次病毒上清液(48 h收集后置换新鲜完全培养基),将两次收集的上清液混合,进行离心浓缩和病毒管分装,−80°C冰箱保存。
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将生长状态良好的HEK-293T细胞消化计数后稀释至 1×105个/ml, 加入96孔板,100 µl/孔,为每个病毒准备6个孔。放入37°C 、5% CO2 培养箱中培养。将病毒进行3倍梯度稀释,共6个稀释度,接种于293T细胞,继续培养48 h后,在荧光显微镜下观察结果。在观察结果前6 h需更换新鲜10% FBS完全培养基,从孔中吸出80 µl培养基,然后加入80 µl新鲜10 % FBS完全培养基,放入37°C、5% CO2 培养箱中培养。6 h后荧光显微镜下观察结果,荧光或活细胞百分比在10%~50% 的孔计算病毒滴度。目的病毒命名为LV-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法,阴性对照病毒命名为LV-LUC-PURO。
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将AML12小鼠正常肝细胞在含有10% FBS、1% ITS(10 µg/ml胰岛素+5.5 µg/µl转铁蛋白+5 ng/ml硒)、1% 双抗以及40 ng/ml DXMS的DMEM 培养基,于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。AML12细胞在10 cm培养皿中细胞长满以后,用0.25%胰蛋白酶消化,离心收集细胞后稀释成密度为1.5×105个/ml的细胞悬液,接种于6孔板,每孔2 ml,使得第2天细胞的融合率在60% 左右,利于感染。设置实验组LV-ORM1 启动子-LUC-PURO和阴性对照组LV-LUC-PURO,为促进病毒的感染效率,首先,感染时弃原有培养基,添加含5% FBS的新鲜培养液2 ml,其次,添加助感染试剂polybrene,使其最终浓度为7 μg/ml。设置2个(10/20)感染复数(MOI)组,感染24 h后换新鲜完全培养基。在感染48 h后,观察慢病毒颗粒感染效率,倒置荧光显微镜下观察荧光比例以确定最佳感染效率,最终选定MOI=20的分组进行后续实验。
待细胞融合率达60% 时,用嘌呤毒素(0.8 μg/ml)浓度处理48 h,然后换新鲜的嘌呤毒素培养基继续处理,细胞密度超过80%时则进行传代处理,后续每隔2~3 d更换含嘌呤毒素培养基扩大培养,经过反复挑取抗药性细胞后获得的稳定转染细胞,命名为LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法,阴性对照细胞株命名为LV-AML12-LUC-PURO。
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使用TRIzol试剂提取组织总RNA,使用反转录试剂盒将其逆转录成cDNA,然后进行PCR扩增,采用2–ΔΔCT分析目的基因的相对表达量,引物序列见表3。
引物名称 引物序列(5′—3′) Luciferase-F CGCACATATCGAGGTGGACA Luciferase-R GCAAGCTATTCTCGCTGCAC mGapdh-F GTCAAGGCCGAGAATGGGAA mGapdh-R CTCGTGGTTCACACCCATCA 注:qPCR: 实时荧光定量聚合酶链式反应; mGapdh:小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶; F: 正向引物; R: 反向引物。 -
使用二甲基亚砜(DMSO)和DXMS来验证LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO作为药物筛选工具的有效性和可行性。将LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO稳转细胞株培养于96孔黑色侧壁透明底板,用10 μmol/L DXMS处理12 h,同时用0.1% DMSO作为溶剂对照组。参照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书,加入80 µl检测溶液,细胞充分裂解后在酶标仪中检测荧光素发光值。
为了评估本高通量细胞筛选平台的精确性和稳定性,使用Z′因子作为度量标准,Z′因子是高通量筛选中常用来评估和验证的主要统计参数之一:
式中σDMSO和σDXMS分别为阴性对照组和阳性对照组的标准差,μDMSO和μDXMS分别为阴性对照组和阳性对照组的平均值。若0.5<Z′≤1,则认为此筛选模型具有良好的精确性与稳定性。
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基于对美国食品药品监督管理局(FDA)批准的药物库的筛选,选用陶术生物的FDA上市药物库,筛选可靶向升高ORM的药物。
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实验数据使用软件 GraphPad Prism 9 进行作图和分析。两组间比较用t检验,以 P<0.05 为差异具有统计学意义。
Establishment of a high-throughput screening platform based on drug repurposing targeting alpha-1-acid glycoprotein and discovery of potential weight loss drugs
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202309057
- Received Date: 2023-09-25
- Rev Recd Date: 2024-02-04
- Available Online: 2024-03-20
- Publish Date: 2024-03-25
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Key words:
- drug repurposing /
- ORM /
- high-throughput screening /
- obesity /
- weight loss drugs
Abstract:
Citation: | CHEN Feng, YANG Cirong, ZHANG Zhen, CHEN Fei, LIU Xia. Establishment of a high-throughput screening platform based on drug repurposing targeting alpha-1-acid glycoprotein and discovery of potential weight loss drugs[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(3): 114-120. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202309057 |