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近年来,侵袭性真菌感染(IFD)的发病率和病死率逐年增高,临床上常见的侵袭性真菌主要有以念珠菌为主的酵母样真菌和以曲霉为主的丝状真菌。而念珠菌引起的IFD的总发病率达0.03%~0.50%,病死率可达35%~80%[1],白念珠菌(Candida albicans)是侵袭性真菌感染中最常见的致病真菌,约占40.1%[2]。尽管目前已研发出有效的抗真菌药物可供临床治疗,但仍存在着耐药性、价格昂贵、毒性大等问题亟需解决[3]。随着抗真菌药物经年累月使用,耐药性问题越发突出。唑类药物是临床常用的抗真菌药物,疗效好、毒性低,但因应用历史较长,临床上对其耐药的真菌越来越多[4]。目前,临床可选择的药物数量有限,解决真菌对药物的耐药性问题便成为一个必须攻克的难关。联合用药是一种有效的克服药物耐药性的方法,两者的协同作用不仅可以克服药物的耐药性,还可以增强原有药物的抗真菌作用[4]。
去甲泽拉木醛(DMZ)是从雷公藤根皮中提取的三萜类单体化合物,是雷公藤中含量较高的单体成分,其分子式是C29H36O6(图1)。DMZ具有抗炎、抗癌、免疫调节、抗生育、雌激素代谢调节等药理活性[5],但其在抗真菌方面的研究尚未见报道。本研究发现,DMZ具有良好的广谱抗真菌活性,并且与氟康唑联合使用具有协同抗耐药真菌作用。
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测定DMZ对临床中常见的病原真菌的抗菌活性,共计23株。实验结果显示,DMZ对所试真菌都有一定的抑制效果(表1)。对白念珠菌(含11株临床株)的MIC范围为4~16 g/L,值得注意的是,其中有3株临床菌对FLC显示出较强的耐药性(901、904、632),DMZ对它们的MIC稳定在8 g/L,表现出与敏感菌类似的抗菌活性。对FLC天然耐药的耳念珠菌与克柔念珠菌,DMZ也表现出较好的抗真菌活性,MIC分别为32 g/L、2~8 g/L。对其他的念珠菌如热带念珠菌、近平滑念珠菌也有较强的抗菌活性,MIC为4~16 g/L,对丝状菌如烟曲霉菌、须毛癣菌有较好的抗菌活性,MIC分别为32 g/L和2 g/L。以上结果表明,DMZ对常见的病原真菌均表现出较好的抗菌活性,抗菌谱较广。
菌种 菌株 MIC80(g/L) FLC DMZ 白念珠菌 FLC敏感菌株 SC5314 0.25 8 7654 0.25 4 103 2 16 9161 0.25 4 10066 2 8 10060 0.25 4 10061 0.25 4 7879 1 8 9296 0.25 8 FLC耐药菌株 901 64 8 904 64 8 632 64 8 耳念珠菌 0029 64 32 热带念珠菌 8915 16 8 409 1 16 烟曲霉 7544 64 32 近平滑念珠菌 22019 2 4 90018 1 8 克柔念珠菌 4996 16 8 62588 16 8 10153 32 2 须毛癣菌 T5b 32 2 T5a 32 2 -
选取3株对FLC耐药的白念珠菌901、904和632,采用棋盘微量液基稀释法考察DMZ与FLC联合使用是否存在协同作用。结果显示,在与2 g/L DMZ联合使用的情况下,FLC对上述3株耐药菌的有效浓度从64 g/L降低至0.25 g/L(表2),是原抗菌浓度的1/256,两药联合使用的FICI为0.129~0.254,表明DMZ与FLC具有较强的协同抗耐药菌作用。
菌株 MIC80(g/L) 协同指数 单用FLC 单用DMZ 联用FLC 联用DMZ 901 64 8 0.25 2 0.129 904 64 16 0.25 2 0.254 632 64 8 0.25 2 0.254 应用琼脂平板扩散实验更直观地验证了DMZ与FLC的协同抗真菌作用。结果显示,在单用DMZ的情况下,不同浓度的DMZ均产生了明显的抑菌圈,但抑菌圈直径的大小并没有显示出剂量依赖性;单用FLC能产生较大的抑菌圈,但抑菌作用较弱,抑菌圈内部仍有少量真菌菌落生长(图2A)。进一步用抑菌圈实验验证两药联用对耐药菌的抗真菌效果。结果显示,在含有一定浓度DMZ的琼脂中,真菌长得稀薄,DMZ的浓度越高,真菌长得越稀薄,表现出剂量依赖性。在含有不同浓度FLC的纸片周围都出现了直径较大的抑菌圈(图2B),抑菌圈的大小与FLC的含量呈现出明显的剂量依赖关系。上述实验结果表明,DMZ与FLC联合使用具有协同抗耐药菌的作用。
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利用CCK-8法考察DMZ对小鼠胚胎成纤维细胞的毒性。CCK-8试剂中含有WST-8,在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物,生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此,可利用这一特性考察DMZ对哺乳动物细胞的毒性。结果显示,当DMZ浓度为32 g/L时,小鼠胚胎成纤维细胞的存活率下降到54%,显示出一定毒性,而低于32 g/L时DMZ的毒性较低,没有表现出显著的细胞毒作用(图3)。实验结果通过单因素方差分析(ANOVA),然后进行事后Dunnett-t检验,标准偏差基于3次独立实验。
Study on antifungal effect of demethylzelamaldehyde in vitro
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310011
- Received Date: 2023-10-10
- Rev Recd Date: 2024-02-20
- Available Online: 2024-04-24
- Publish Date: 2024-04-25
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Key words:
- Candida albicans /
- demethylzeylasteral /
- fluconazole /
- synergistic effects /
- drug resistance
Abstract:
Citation: | HAN Lei, ZHONG Hua, WANG Xinrong, WANG Yan. Study on antifungal effect of demethylzelamaldehyde in vitro[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(4): 151-156. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310011 |