-
抗真菌感染尤其深部真菌感染是抗微生物感染的重要研究内容,也是全球范围医学研究中面临的严峻挑战。近年来,在免疫力低下和重症监护病房患者中[1],真菌感染发病率和死亡率逐年增加,其中在侵袭性念珠菌病中,死亡率约为40%[2]。白色念珠菌是真菌感染中最常见的病原体,可以在正常人体的皮肤、口腔、阴道和肠道等部位定植[3]。临床上,多烯类、棘白菌素类、唑类和烯丙胺类药物是治疗真菌感染最常用的药物[4],然而由于白色念珠菌的耐药性、形成生物被膜以及部分药物较大的毒副作用等问题,传统抗真菌药物的应用面临新的挑战[5]。因此,增加现有抗真菌药物的药效,降低其毒副作用,是抗真菌药物研发的重要方向。利用药物新剂型的研究降低其毒副作用是有效的药物研发途径。例如,成功上市的两性霉素B脂质体即可极大降低两性霉素B的肾脏毒性[6]。
醋酸卡泊芬净(CAS)是一种棘白菌素半合成类抗真菌药,作用于真菌细胞的细胞壁,能有效抑制细胞壁中β-1,3-D-葡聚糖的生物合成,是目前白色念珠菌系统性感染治疗中的一线推荐药物。然而,CAS价格昂贵,通过药物合用的方式,维持或增强卡波芬净的治疗效果,降低其使用剂量,可以显著减少患者的用药成本。与此同时,降低药物剂量可以减少卡泊芬净的毒副作用。有研究显示,患者在接受高于批准剂量三倍的CAS作用下高剂量组中65%的患者会出现肝毒性,包括肝酶升高和肝衰竭[7]。我们在前期研究中发现单硬脂酸甘油酯(GMS)与CAS联合用药具有良好的协同作用,增强CAS体外抑菌效果,如两者联用体外抑菌MIC由
0.0625 μg/ml降低到0.0313 μg/ml[8]。然而,GMS与CAS混合使用,由于溶解性差异和药代动力学不同,可能无法在体内同时达到作用部位,共同杀灭真菌,本研究通过制备醋酸卡泊芬净单硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒为上述问题解决提供思路,并发挥体内协同抗菌的效果。固体脂质纳米颗粒(SLNs)以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体,将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成的纳米给药系统[9],可以包载亲脂性或者亲水性药物,提高药物的稳定性[10]。具有毒性低生物相容性好、物理稳定性好、体循环中药物不易泄露的特点[11]。通过药物协同增加抑真菌作用,可以减少给药用量与给药次数,提高药物疗效;进而降低抗真菌药物的毒副反应;同时减少真菌耐药性的产生[12]。基于以上研究基础,本研究以单硬脂酸甘油酯作为载体材料制备卡泊芬净固体脂质纳米粒,考察纳米粒对卡泊芬净的协同增效作用。
-
专属性:液相色谱图见图1,CAS出峰位置处无SLNs色谱法干扰,建立方法专属性良好。CAS保留时间为6.8min,载体对CAS-SLNs测定无干扰。
线性和范围:如图1所示,方法专属性良好,以CAS浓度(C, μg/ml)为横坐标,所测得峰面积(Area)为纵坐标绘制标准曲线,回归方程为A=0.1687C−
0.0381 ,R2=0.9999 ,表明CAS在1 μg/ml~50 μg/ml内线性关系良好。精密度:由表1可知,低、中、高浓度CAS日内精密度和日间精密度RSD值均小于5%,表明所建立方法的精密度满足要求。
加样量(μg/ml) 日内精密度 日间精密度 测得量(μg/ml) RSD(%) 测得量(μg/ml) RSD(%) 5 4.79±0.05 1.07 4.79±0.04 0.90 20 19.64±0.17 0.87 19.90±0.26 1.32 40 38.48±0.21 0.55 38.17±0.57 1.49 稳定性:同一样品在12 h以内的RSD为1.88%,表明含量测定供试品溶液的稳定性满足要求。
回收率:由表2可知,样品在低、中、高三个浓度的回收率在95%-115%范围内,且RSD值均小于5%,表明该方法稳定可靠,可用于样品中CAS含量的测定。
加样量(μg/ml) 测得量(μg/ml) 平均回收率(%) RSD(%) 5 5.29±0.12 105.78±2.41 2.28 20 20.95±0.48 104.76±2.40 2.29 40 43.39±0.59 108.48±1.47 1.35 -
制备CAS-SLNs并对其进行表征。CAS-SLNs的粒径、Zeta电位分别为135.97±1.73 nm,19.33±0.37 mV。如图2所示,透射电镜照片显示CAS-SLNs为类圆形粒子,粒径约为120 nm。纳米粒包封率为67.71±1.74%,载药量为7.55±0.68%。
-
前期本课题组研究表明,GMS可以协同CAS抑制白色念珠菌的生长,因此我们比较了CAS-SLNs与CAS单用以及CAS+GMS合用的体外抗真菌活性。
结果如表3所示,与1 μg/ml的GMS合用后,CAS的MIC从3.13×10-2 μg/ml降低到7.83×10-3 μg/ml,白色念珠菌对CAS的敏感性增加了4倍,表明CAS可以协同GMS抑制念珠菌的生长;而本课题制备的CAS-SLNs MIC为9.78×10-4 μg/ml,这与单用CAS的MIC 3.13×10-2 μg/ml相比,活性增强了32倍,这表明CAS-SLNs可以进一步发挥CAS与GMS的协同作用抑制念珠菌的生长,其抑菌活性性优于CAS和GMS物理混合组。
菌株名称 CAS CAS+GMS CAS+SLNs CAS-SLNs C.albicans SC5314 3.13×10−2 μg/ml 7.83×10−3 μg/ml 3.13×10−2 μg/ml 9.78×10−4 μg/ml -
菌丝态与酵母态混合形成的被膜是白色念珠菌耐药的重要因素,卡泊芬净单用可以显著抑制白色念珠菌被膜的形成,为了探究CAS-SLNs的优效性,我们采用结晶紫染色法定量检测了各组药物处理后白色念珠菌生物被膜的形成情况。结果如图3显示,CAS组在1.96×10-3 mg/ml、9.78×10-4 mg/ml、4.89×10-4 mg/ml浓度下的被膜形成抑制率分别为37.30±4.40%、36.50±5.78%、30.70±8.96%,CAS-SLNs组在同等的1.96×10-3 mg/ml、9.78×10- 4 mg/ml、4.89×10-4 mg/ml浓度下,被膜形成的抑制率分别为85.03±1.59%、68.05±7.72%、56.12±2.83%。由此可见CAS-SLNs对生物被膜形成的抑制作用与单用CAS相比显著增强。
-
在小鼠系统性白色念珠菌感染模型中,如图4A所示,白色念珠菌感染可以导致小鼠体重的下降,而药物治疗可以恢复小鼠的体重增长。结果显示,CAS组小鼠平均体重由25.93 g增长至28.73 g,增长10.8%;而CAS-SLNs组体重由25.29 g增长至29.43 g,体重增长16.36%;对照组(对照组第10天存活率为0)与CAS-SLNs有非常显著的差异(P<0.01),CAS-SLNs组体重恢复更加显著。此外,CAS-SLNs治疗也可以显著降低小鼠肾脏的载菌量。如图4B所示,对照组、CAS组、CAS-SLNs组的载菌量分别为5.84±0.05 CFU/g、5.18±0.03 CFU/g、5.10±0.06 CFU/g,与对照组有肾脏载菌量极其显著差异(P<0.001),CAS-SLNs组与CAS组也有显著性差异(P<0.05)。通过PAS染色,考察小鼠肾脏的白色念珠菌感染情况,如图4C所示,在SC5314感染小鼠48 h后,对照组肾部病理切片经过PAS染色出现大量白色念珠菌。在感染小鼠经过CAS治疗后,白色念珠菌的数量明显下降。而经过同等剂量的CAS-SLNs治疗的感染小鼠肾部组织切片很少发现白色念珠菌的存在。综上所述,CAS-SLNs作为以GMS为主要材料的载体包载药物CAS,其抗菌效果优于单用CAS,可以在体内发挥CAS与GMS的协同作用,体内抗菌效果显著增强。
Study on the synergistic antifungal effects of Caspofungin Acetate loaded glyceryl monostearate nanoparticle on Candida albicans
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310043
- Received Date: 2023-10-22
- Rev Recd Date: 2024-05-30
-
Key words:
- Candida albicans /
- Caspofungin Acetate /
- glyceryl monostearate solid lipid nanoparticles /
- synergistic antifungal
Abstract:
Citation: | GUO Lingyi, LIU Yanchao, GAO LU, LIU Ruiyao, LV Quanzhen, YU Yuan. Study on the synergistic antifungal effects of Caspofungin Acetate loaded glyceryl monostearate nanoparticle on Candida albicans[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310043 |