Study on Anti-constipation Effect of Black Garlic Polysaccharide

黑蒜（上海明可名生物科技有限公司，批号：20231030），乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，北京韩美药品有限公司，批号：22110047），复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，仁和堂医药连锁股份有限公司，批号：210804）。

D-无水葡萄糖（源叶生物，S22J12H137237）、无水乙醇（泰坦科技，P2708277），生理盐水（雷根生物，230327042），4%多聚甲醛（博光生物，HP184401），浓硫酸（20230420）、丙酮（20230807）、石油醚（20220507）均购自国药集团，三氯乙酸（C14990699）、活性炭粉（C14853603）、阿拉伯树胶粉（C15109301）、苯酚（C15031044）均购自麦克林生化，所有水均为超纯水机所制一级水。

鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸），循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器），万分之一天平JA1003（恒平仪器），电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器），高速离心机M18G（创宜生物），旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器），超纯水机Smart-S（和泰仪器）。

SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，杭州子源实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK（浙）2019-00004。

取10 g黑蒜，按下列步骤处理：（1）脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60 ℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。（2）水提：所得脱脂黑蒜粉用80 ℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。（3）脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4 ℃静置10 h，离心取上清液。（4）醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4 ℃静置12 h，离心取沉淀。（5）干燥：挥干有机溶剂，烘箱60 ℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。

采用苯酚-硫酸法^[14]测定多糖含量。

精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。

精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。

计算公式：黑蒜多糖得率（%）=$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $

黑蒜多糖纯度（%）=$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $

式中：$ W $1为黑蒜质量（g）；$ W $2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $为提取溶剂体积（ml）；$ D $为样品稀释倍数。

乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d^[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。

CO.D混悬液：参考贾红慧等^[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。

黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等^[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。

墨汁^[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。

含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。

小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。

按照0.1 ml/10 g灌胃给药。（1）给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/天，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。（2）造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。（3）给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。

计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%

分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。

计算公式：粪便含水量（%）=$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $

式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。

采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（$ \bar{X}\pm S $）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。

精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度为横坐标（c/mg·ml⁻¹），吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=2.2829x+0.0764，相关系数r=0.9982，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。

从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。

从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。

从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。

CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，以减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药^[19]。因此，本文建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。即成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10^[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况^[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。

FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关^[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖^[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便^[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少是老年人易发生便秘的主要原因^[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。