Extraction Process Optimization and Quality Control of Xuetong Capsules

LC-20AD岛津高效液相色谱仪、ShimNex C₁₈-AQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（日本岛津公司）；XS105DU分析天平[梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司]；100SD极脉超声波清洗机（深圳市超洁科技实业有限公司）等。

乙腈（HPLC梯度级，批号：0134240402D，上海星可高纯溶剂有限公司）、无水乙醇（分析纯，批号：20231213）、磷酸（HPLC梯度级，批号：20230807）、盐酸（分析纯，批号：20230331）、三氯甲烷（分析纯，批号：20220901）均购于国药集团化学试剂有限公司；何首乌（批号：2023041002，上海华济药业有限公司，经上海中医药大学附属龙华医院史秀峰主任药师鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根）、大黄（批号：2024021901，上海华济药业有限公司，经上海中医药大学附属龙华医院史秀峰主任药师鉴定为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄 Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.或药用大黄 Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎）、芦荟大黄素（含量97.5%，批号：110795-202211）、二苯乙烯苷（含量97.9%，批号：10844-202317）、大黄酸（含量95%，批号：110757-202308）、大黄素（含量96.0%，批号：110756-201913）、大黄酚（含量99.8%，批号：110796-202011）、大黄素甲醚（含量98.9%，批号：110758-202218）均购于中国食品药品检定研究院；血通胶囊（批号：240101、240102、240103，上海市黄浦区香山中医医院自制制剂）。

ShimNex C₁₈-AQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，17%A；15～40 min，17%～80%A；40～50 min，80%A）；检测波长：双波长254 nm（芦荟大黄素），320 nm（二苯乙烯苷）；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl。

取二苯乙烯苷、芦荟大黄素对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加稀乙醇溶解稀释，定容，摇匀即得429.98 μg/ml芦荟大黄素、323.07 μg/ml二苯乙烯苷混合对照品溶液。

称取0.4 g干膏粉，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25 ml，称定重量，加热回流30 min，放冷，称定重量，用稀乙醇补足重量，摇匀，静置，上清液滤过，即得。

按照2.1.1项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂稀乙醇溶液各10 μl进样测定。结果显示，供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图相同的保留时间上有相同的色谱峰，而空白溶剂稀乙醇溶液在同一位置没有检查到色谱峰，表明专属性良好，见图1。

取2.1.2项下对照品溶液适量，加稀乙醇按比例稀释，定容至刻度，混匀，使二苯乙烯苷的含量为20.19、40.38、80.77、161.54、323.07 μg/ml，芦荟大黄素的含量为26.87、53.75、107.49、214.99、429.98 μg/ml。按2.1.1项下色谱条件进样10 μl，测定峰面积（Y），以样品浓度（X）进行线性回归，计算回归方程。二苯乙烯苷：Y=42 381 X−15 930，r=0.999 8；芦荟大黄素：Y=15 707 X+9 782.4，r=0.999 8。结果表明，二苯乙烯苷在20.19~323.07 μg/ml、芦荟大黄素在26.87~429.98 μg/ml范围内线性关系良好。

精密吸取混合对照品溶液10 μl，按2.1.1项下色谱条件重复进样5次，按峰面积计算二苯乙烯苷、芦荟大黄素的RSD，分别为0.29%、0.17%（n = 5）。表明仪器精密度良好。

按2.1.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，按2.1.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8 h各进样1次，记录峰面积，计算得到二苯乙烯苷、芦荟大黄素的RSD，分别为0.24%、0.75%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

按2.1.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液5份，精密吸取10 μl，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到二苯乙烯苷、芦荟大黄素的含量分别为6.05、6.60 mg/g；RSD分别为0.14%、0.55%（n=5），表明方法的重复性良好。

取已知二苯乙烯苷、芦荟大黄素含量的浸膏粉9份，每份约0.4 g，精密称定，分别加入相当于二苯乙烯苷、芦荟大黄素含量80%、100%、120%的对照品溶液适量，按2.1.3项下制备供试品溶液，并测定含量，计算样品的加样回收率。结果二苯乙烯苷的平均加样回收率为98.57%，RSD为0.98%（n=9）；芦荟大黄素的平均加样回收率为97.55%，RSD为1.10%（n=9）。

选择乙醇回流法对何首乌和大黄进行提取。利用正交试验设计手段，本研究以何首乌中的二苯乙烯苷和大黄中的芦荟大黄素含量及其浸膏得率作为评价指标，对乙醇用量（因素A）、乙醇浓度（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）进行考察，见表1。

称取何首乌和大黄饮片各10 g，根据正交试验设计安排表进行实验（表2）。乙醇回流法提取，每组提取后合并提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇至稠膏状，放置于真空干燥箱内（设定温度为60℃~75℃，压力控制在0.04~0.08 MPa，持续时间12~24 h）进行烘干处理。烘干完毕的物料经过粉碎成干燥的膏状粉末。然后，通过测量该粉末的质量来计算提取率，并据此得到浸膏的提取效率。

依据所得二苯乙烯苷、芦荟大黄素的含量以及浸膏得率，按公式[综合评分=0.3×二苯乙烯苷含量/实验中二苯乙烯苷含量最大值+0.3×芦荟大黄素含量/实验中芦荟大黄素含量最大值+0.4×浸膏得率/实验中浸膏得率最大值]，计算综合评分，见表2、表3。

由表2、表3可见，各因素对乙醇回流法无显著性影响（P>0.05），根据影响力大小排序为：D>B>C>A。正交试验结果得出最佳提取工艺条件为A₃B₂C₁D₃。考虑到节约资源、提高效率的原则，参考评分结果，确定最佳工艺为A₃B₂C₁D₃，即加入处方药材质量10倍的70%乙醇，提取3次，每次1 h。

称取正交试验处方量药材3份，按最佳工艺进行验证实验，浸膏得率平均值为28.80%，RSD为0.73%（n=3）；二苯乙烯苷和芦荟大黄素平均含量分别为6.04、6.60 mg/g，RSD分别为0.25%、0.80% （n=3），说明优选的提取工艺稳定、可行。

色谱柱：ShimNex C₁₈-AQ柱,（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液=85∶15，检测波长：254 nm，流速：1.0 ml/min，进样量：10 μl。

精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚适量，置于100 ml量瓶中，加适量甲醇超声、水浴加热使其充分溶解，放置室温后再用甲醇定容至刻度，制成含芦荟大黄素106.67 μg/ml，大黄酸104.41 μg/ml、大黄素207.74 μg/ml、大黄酚210.38 μg/ml和大黄素甲醚191.47 μg/ml的混合对照品溶液，备用。

精密称定优化提取工艺后制备的血通胶囊样品（批号：240101）0.45 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，至烧瓶中，挥去溶剂，加8%的盐酸溶液10 ml，加热回流1 h，放冷，至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并溶液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按血通胶囊处方比例称取除大黄、何首乌外的药材适量，按照处方工艺及供试品溶液制备方法，制得阴性对照溶液。

按照3.1项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl进样测定。结果显示，供试品溶液色谱图与对照品溶液色谱图相同的保留时间上有相同的色谱峰，而阴性对照溶液在同一位置没有检查到色谱峰，表明专属性良好，见图2。

取3.2项下对照品溶液适量，加甲醇稀释，定容至刻度，混匀，使芦荟大黄素的含量为2.73、6.83、17.07、42.67、106.67 μg/ml，大黄酸含量为2.67、6.68、16.70、41.76、104.41 μg/ml，大黄素含量为5.32、13.30、33.24、83.10、207.74 μg/ml，大黄酚含量为5.39、13.46、33.66、84.15、210.38 μg/ml，大黄素甲醚含量为4.90、12.25、30.64、75.59、191.47 μg/ml。按3.1项下色谱条件进样10 μl，测定峰面积（Y），以样品浓度（X）进行线性回归，计算回归方程。芦荟大黄素：Y=51 669X+13 430，r=0.999 8；大黄酸：Y=42 556 X−62 801，r=0.999 7；大黄素：Y=39 484 X−51 629，r=0.999 8；大黄酚：Y=53 244 X−69 950，r=0.999 9；大黄素甲醚：Y=15 518 X+4 047，r=0.999 8。结果表明，芦荟大黄素在2.73~106.67 μg/ml、大黄酸在2.67~104.41 μg/ml、大黄素在5.32~207.74 μg/ml、大黄酚在5.39~210.38 μg/ml、大黄素甲醚在4.90~191.47 μg/ml范围内线性关系良好。

精密吸取对照品混合溶液10 μl，按3.1项下色谱条件重复进样5次，按峰面积计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD，分别为0.52%、0.20%、0.57%、0.26%和0.84%（n = 5）。表明仪器精密度良好。

按3.3项下供试品溶液制备方法制备血通胶囊供试品溶液（批号：240101），精密吸取10 μl，按3.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8 h各进样1次，记录峰面积，计算得到芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为0.38%、0.57%、0.59%、0.60%和0.58%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

按3.3项下供试品溶液制备方法制备血通胶囊供试品溶液（批号240101）6份，精密吸取10 μl，按3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为0.635、0.677、1.965、2.518、1.070 mg/g；RSD分别为0.96%、0.87%、0.47%、0.89% 和0.72%（n=6），表明方法的重复性良好。

取同一批号已知芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的血通胶囊9份（批号：240101），每份约0.45 g，精密称定，分别加入相对于5种蒽醌类成分含量80%、100%、120%的对照品溶液适量，按3.3项下制备供试品溶液并测定含量，计算样品的加样回收率。结果芦荟大黄素96.85%，RSD为1.62%（n=9）；大黄酸95.76%，RSD为1.48%（n=9）；大黄素95.64%，RSD为1.66%（n=9）；大黄酚93.66%，RSD为1.56%（n=9）；大黄素甲醚94.71%，RSD为1.64%（n = 9）。

取3批血通胶囊样品约0.45 g，分别按3.3项下供试品溶液制备方法平行制备9份供试品溶液，按3.1色谱条件测定峰面积，计算含量，结果见表4。

血通胶囊原制剂工艺中，水蛭、大黄、何首乌三味药材均为药材原粉入药，制剂服用量偏大，卫生学检查难以合格，因此，本研究分别对大黄、何首乌二味药材的提取工艺进行了筛选优化。张绵松等^[8]研究证实何首乌醇提物体外抗氧和抑菌作用明显强于水提物。李冰韶等^[9]研究发现，大黄醇提物中蒽醌类成分含量高于水提物，且降脂效果更强。因此，本研究选择乙醇回流法对何首乌和大黄进行提取，采用正交试验设计法对乙醇用量、浓度、提取时间、次数等因素进行考察。

正交试验结果显示，血通胶囊提取物中二苯乙烯苷含量、芦荟大黄素含量、浸膏得率综合评分最高是实验8，根据直观分析可知，被考察因素对综合评分重要性排序为因素D>因素B>因素C>因素A，确定最优提取工艺为A₃B₂C₁D₃，即加10倍乙醇，乙醇浓度70%，提取3次，每次1 h。验证实验结果表明该方法重复性好，提取效率较高。

血通胶囊的原始质量控制标准仅有的薄层色谱法定性鉴别，并未设立定量的质量控制标准。本研究根据2020年版发布的《中国药典》所列出的规范^[10]，对血通胶囊中5个蒽醌类化合物进行含量测定。检测结果显示，三批血通胶囊蒽醌类成分含量稳定，表明该提取方法制备的血通胶囊稳定可靠。本研究结果为血通胶囊的质量控制及进一步研究奠定基础。