Progress on mRNA tumor vaccine with non-viral delivery system

mRNA肿瘤疫苗的研究发端于 20 世纪 70 年代。1976年，Langer等^[9]首次使用了聚合物纳米颗粒和微颗粒作为载体来封装核酸。随后2年，又实现将外源性mRNA通过脂质体递送到宿主细胞，进一步拓展了mRNA技术的应用^[10]。1990年，Wolff等^[11]将含有氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶基因的RNA和DNA表达载体分别注射到小鼠体内骨骼肌中，在所有小鼠体内都检测到了相应蛋白质的表达，为mRNA用作治疗药物的研究奠定了基础。mRNA疫苗的概念可以追溯到1993年，Martinon等^[12]在用编码流感病毒蛋白的mRNA免疫的小鼠中观察到细胞毒性T淋巴细胞的诱导，揭示了mRNA作为编码抗原的基因在疫苗研究领域的应用潜能。1995年，Conry 等^[13]构建了编码荧光素酶和人癌胚抗原（carcinoem bryonic antigen，CEA）的mRNA剪切体，该mRNA剪切体在体外小鼠成纤维细胞中定向表达CEA， mRNA肿瘤疫苗的概念被首次提出。近年来，COVID-19的流行推动了mRNA疫苗的深入研究和技术的发展，并使mRNA肿瘤疫苗再次受到关注。事实上，COVID-19疫苗的快速发展得益于多年来在临床前和临床试验中以mRNA疫苗作为肿瘤治疗策略的相关研究。因此，mRNA疫苗是未来肿瘤治疗有希望的候选疗法之一。

由于mRNA存在不稳定性、高免疫原性、递送效率低等问题，开发高效的靶向递送系统是mRNA疫苗亟待解决的问题。mRNA疫苗递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体。目前，多数的临床基因治疗试验采用病毒载体。然而，病毒载体存在易于刺激免疫原性反应产生和诱导基因插入突变等问题，其临床安全性一直受到质疑。而包括脂质纳米粒、聚合物、肽类、无机材料在内的非病毒载体，具有强大的基因装载能力、高度的安全性和实用性，且其制备较为简单。因此，非病毒载体在进一步的临床开发和应用中显示出巨大的潜力^[14]。

脂质纳米颗粒是一种临床批准的用于核酸递送的多功能平台^[15]。截至2023年11月，3种基于LNP的药物（1种siRNA，2种mRNA）已获得美国食品药品监督管理局批准，超过50种候选药物正在临床试验中，用于治疗或预防传染病、肿瘤和遗传性疾病^[16]。

LNP脂质壳结构由脂质或类脂材料以及辅助成分（包括胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质）组成（图2）。这些成分可促进单分散纳米颗粒的形成、提高纳米颗粒的稳定性、实现有效的核酸封装、增加细胞摄取和促进mRNA的内体逃逸。其中，辅助磷脂可以调节 LNP 双分子层的流动性，促进内体逃逸^[17]；胆固醇通过填充磷脂间的空隙来调节膜的流动性，促进膜融合。聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）化脂质控制LNP的大小和稳定性，介导LNP的间接靶向能力以及保护LNP免受巨噬细胞介导的清除^[18,19]；LNP 配方中最重要的成分为阳离子脂质或可电离脂质，在早期的研究中主要使用阳离子脂质，如（2,3-二油酰基-丙基）-三甲基氯化铵[（2, 3-dioleyl-propyl）-trimethyl ammonium chloride, DOTAP]和1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷（1, 2-didecaenooxy-3-methyl ammonium propane, DOTMA）。然而阳离子脂质具有高免疫原性和较强的毒性^[20]。

可电离脂质具有pH敏感性，其在酸性条件下带正电荷，在生理pH条件下接近中性^[21,22]。这种特性使它们在体内分布时更少地与血清成分相互作用。当可电离脂质纳米粒进入细胞的酸性内体后，它们可以被质子化，从而帮助mRNA逃逸到细胞质中。常用的可电离脂质有1,2-二甲氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷（DLin-DMA）、N,N-二甲基-2,2-二-（9Z,12Z）-9,12-十八碳二烯-1-基-1,3-二氧戊环-4-乙胺（DLin-KC2-DMA）和4-（N,N-二甲基氨基）丁酸（二亚油基）甲酯（DLin-MC3-DMA）。可电离脂质的结构改变可引起 mRNA递送效率的改变，如Dong等^[23]合成了含有不同头部基团的二氨基（DAL）可电离脂质材料，用于包载编码IL-12、IL-27和GM-CSF等细胞因子的mRNA。使用DAL-LNP对携带B16F10黑色素瘤的小鼠进行治疗性疫苗接种，结果显示通过DAL-LNP在瘤内给药IL-12和IL-27 mRNA促进了B16F10黑色素瘤生长的持续抑制，且没有引起明显的毒性。

此外，在LNP的表面进行靶向免疫细胞表面受体的功能性修饰，或与佐剂共同给药，可增强免疫刺激。Shi等^[24]将 Pam2Cys（一种可通过 Toll 样受体（TLR）2/6 途径发出信号的简单合成代谢脂氨基酸）引入 LNP，实现了与 mRNA 的共同递送。结果显示，使用由此产生的 mRNA-LNP （Pam2Cys）进行免疫，可通过诱导 IL-12 和 IL-17 等细胞因子改善肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymph nodes，TDLN）的免疫微环境。

目前常用于mRNA递送的聚合物材料主要有聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）、基于聚酰胺-胺（poly-amindoamine，PAMAM）和聚丙烯亚胺（polypropylenimine，PPI）的树枝状大分子、聚氨基酯（poly β-aminoester，PBAE）、壳聚糖等^[25]（图3）。与LNP相比，基于聚合物的递送系统具有较高的多分散性、分子量和电荷密度，这导致基于聚合物的递送系统纯度较低、清除率较低且毒性较大。因此，它们在mRNA递送方面的临床应用不如可电离脂质纳米粒广泛。为了提高聚合物材料的转染效率和稳定性，并降低其毒性，人们对其结构进行了改造，包括添加脂质尾部、超支化基团和可生物降解分子^[26]。

PEI含有大量的氨基，在生理pH值下可被质子化带正电荷。而mRNA是一种带负电的分子。因此，PEI通过静电相互作用与mRNA紧密地结合形成纳米复合物^[27]。此复合物可以有效地压缩mRNA，并在一定程度上保护mRNA免受外界酶的降解^[28]。在体内，PEI充当“质子海绵”促进mRNA释放到细胞质。然而，由于高电荷密度和高分子量，PEI具有较大的全身毒性和低生物降解性。用脂肪链修饰的低分子量PEI已被用于mRNA递送以降低毒性，如Peng等^[29]合成了一种氟烷烃接枝的聚乙烯亚胺（F-PEI）。结果显示由F-PEI和编码肿瘤抗原的mRNA自组装形成的疫苗，无额外的佐剂，即可诱导树突状细胞成熟并触发有效的抗原呈递，从而引发抗肿瘤免疫反应。

树枝状大分子（dendrimers）是一类具有树枝状结构，由低聚物通过支化单元重复、线性连接而成的大分子，其通常由内核、聚合物主链和树枝单元的侧链组成^[30,31]。作为一种阳离子聚合物，树枝状大分子的细胞毒性也需要通过表面改性来降低。England等^[32]使用赖氨酸作为位点选择性锚，通过酰胺化反应引入了聚磺酰精氨酸和咪唑基团对PAMAM（P）和赖氨酸（L）树枝状大分子进行了化学改性。实验结果显示，与市售的转染剂jetPEI® 相比，改性的PAMAM树枝状大分子显示出更高的mRNA转染效率。

除了基于聚合物和脂质纳米粒的载体外，还可以使用基于肽类的载体递送mRNA。肽类由可生物降解的氨基酸组成，因此其具有高度的生物相容性。鱼精蛋白和细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是两种基于肽的载体，可用于mRNA递送。鱼精蛋白是一种天然的富含精氨酸的阳离子蛋白，可以把带负电的mRNA分子络合成纳米级别的核酸颗粒^[33]。此外，鱼精蛋白-mRNA组成的纳米级颗粒还可以进一步制备成脂质纳米颗粒，这种脂质-鱼精蛋白-mRNA（lipid/protamine/mRNA, LPR）的制剂形式，兼有脂质纳米粒和鱼精蛋白的优势^[34,35]。Shen等^[36]制备了一种由鱼精蛋白/mRNA核和脂质壳组成的mRNA肿瘤疫苗（MVP）。结果显示，MVP 中的mRNA核和脂质壳可充分刺激树突状细胞中I型干扰素和炎症细胞因子的表达，在小鼠结直肠肿瘤和黑色素瘤模型中引起了有效的抗肿瘤免疫。

CPPs是一类由不多于30个氨基酸组成的小分子多肽。CPPs在生理pH值下带正电荷，可以与带负电荷的mRNA形成纳米结构^[37]。Men等^[38]将肿瘤细胞裂解液引入到DMP纳米颗粒[由DOTAP和（乙二醇）-b-聚（ε-己内酯）（mPEG-PCL）自组装形成]中，并将CPPs修饰在DMP表面，形成CLSV系统。然后将编码IL-22结合蛋白（interleukin-22 binding protein，IL-22BP）的mRNA与CLSV混合形成CLSV/IL-22BP复合物。结果表明，所构建的CLSV达到了激活免疫反应和增强mRNA递送的双重目的，在体外和体内均表现出较强的抑制肿瘤细胞生长的能力。

无机纳米颗粒是一种多功能纳米平台。虽然INPs的生物相容性不如脂质纳米粒和聚合物，但是INPs可以通过表面功能化修饰，获得具有适当的溶解度和分散性的纳米粒子。并且某些INPs具有磁性和光学性质，可实现对肿瘤的成像和消融^[39]。典型的INPs包括金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、氧化铁纳米粒子、量子点等。

常用的INPs是介孔二氧化硅纳米粒子（mesoporous silica, MSN），其具有孔道均匀、高比表面积、大孔容和可生物降解性等优点。Phua等^[40]开发了一种介孔二氧化硅纳米颗粒-mRNA （MSN-mRNA）皮下递送系统。结果显示，将编码卵清蛋白和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的裸mRNA和C16@MSNs组成的MSN-mRNA疫苗配方应用于小鼠E.G7-OVA预防性肿瘤模型时，产生了显著的肿瘤抑制作用。其次，INPs还可以与聚合物和脂质纳米粒联合，用于mRNA的递送。Shin等^[41]开发了一种基于聚乙烯亚胺修饰的多孔二氧化硅纳米颗粒（PPSN）的递送平台，其携带细胞因子mRNA用于体内局部免疫治疗。结果表明，PPSN在定位mRNA翻译方面明显比美国食品药品监督管理局批准的LNP更有效。该研究显示了PPSN介导的mRNA递送作为肿瘤免疫疗法中基于mRNA治疗的特异性、有效性和安全性平台的潜力。

基于肿瘤的特点编码特异性抗原，使其顺利地被免疫细胞识别以激活免疫应答，是mRNA肿瘤疫苗的核心作用机制。现阶段主要研究的mRNA肿瘤疫苗编码的抗原主要有肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）、肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA）和免疫调节因子3种类型^[42]。通过对非病毒载体和对机体免疫系统的研究不断深入，目前已有多项mRNA肿瘤疫苗进入临床试验。中国进入临床试验阶段的mRNA肿瘤疫苗如表1所示。

肿瘤特异性抗原是体细胞中的非同义突变产生非自体蛋白^[43]，仅在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，因此支持对患者个体肿瘤抗原产生特异性免疫反应^[44]。多个编码TSA的mRNA肿瘤疫苗已完成了Ⅰ/Ⅱ期临床试验^[45]。BNT 122是BioNTech 和Genentech公司联合研发的一款编码胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者的20种新抗原的mRNA疫苗，使用LNP进行静脉注射给药。Ⅰ期临床试验结果显示，在手术切除后的PADC患者中，将BNT 122与化疗和免疫检查点疗法联用时，该mRNA疫苗有潜力地延缓了PDAC患者的复发。目前基于BNT122针对黑色素瘤和结直肠癌的治疗处于Ⅱ期临床试验阶段，针对实体瘤的临床试验即将进行Ⅱ期临床试验^[46]。

肿瘤相关抗原是是一种在正常组织中表达但在肿瘤组织中过表达的抗原。具有肿瘤特异性弱、中枢免疫耐受性强、免疫原性弱的特点^[47]。目前，利用多种TAA组合开发mRNA疫苗已成为一种趋势。BI 1361849是Ludwig癌症研究所研发的一款编码NY-ESO-1、MAGE-C2、MAGE-C1、survivin、5T4和MUC1这6种TAA的mRNA疫苗，其使用鱼精蛋白作为载体。Ⅰb期临床研究评估了BI-1361849联合局部放疗对Ⅳ期非小细胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）患者的有效性和安全性，结果显示，BI-1361849具有良好的耐受性和免疫原性。2017年12月，在美国启动了BI-1361849与 抗程序性死亡配体1 durvalumab和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）抗体tremelimumab联用治疗NSCLC的Ⅰ/Ⅱ期临床试验。

免疫调节因子是一类能够刺激或抑制特定免疫细胞功能的分子，包括细胞因子、共刺激因子等^[48]。靶向肿瘤微环境实现肿瘤免疫治疗是目前抗肿瘤技术研究的热点。免疫调节因子可以重新激活免疫系统的抗肿瘤免疫反应并重塑积极的免疫微环境^[49]。此外，编码免疫调节因子的mRNA疫苗还可作为编码TAA的mRNA疫苗的佐剂。mRNA-2752 是Moderna公司研发的一款编码人 OX40L、IL-23 和 IL-36γ 的mRNA疫苗，其使用LNP作为载药系统，通过瘤内注射给药。在Ⅰ期的一项剂量递增研究（NCT03739931）中，mRNA-2752与免疫检查点阻断治疗剂durvalumab共同给药显示出抗肿瘤作用。目前mRNA-2752针对于三阴性乳腺癌、泌尿上皮癌、淋巴瘤和免疫检查点难治性黑色素瘤和非小细胞肺癌的Ⅰ期临床人体耐受性试验正在进行中。

随着分子生物学的发展，mRNA疫苗给肿瘤免疫治疗带来了前所未有的希望。通过对mRNA化学修饰的改进以及开发更高效的非病毒载体递送系统可以提高mRNA肿瘤疫苗的安全性、稳定性和递送效率。基于基因治疗的良好前景，未来mRNA肿瘤疫苗的非病毒递送系统的主要发展方向可能包含以下几个方面：①将不同类型的非病毒载体联用共同递送mRNA疫苗，以结合不同类型载体的优点，实现提高纳米粒子稳定性、生物相容性和降低毒性等目的。②对非病毒载体进行功能化修饰以实现mRNA肿瘤疫苗的靶向性、光响应性、荧光可视性、pH响应性释放等功能。③阐明非病毒载体结构与其功能的关系，以及进入人体后与肿瘤微环境的相互作用机制。目前，正在开展许多基于脂质纳米颗粒、脂质-鱼精蛋白、阳离子脂质复合物和脂质多聚复合物等非病毒递送系统的mRNA肿瘤疫苗的临床试验。相信伴随多组学技术的发展和跨学科的融合，未来肿瘤特异性抗原的筛选将变得越来越精确。随着对非病毒递送系统研究的不断深入，mRNA肿瘤疫苗将在未来的肿瘤治疗中发挥巨大的作用。