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盐酸普萘洛尔（propranolol hydrochloride，PPL）是治疗婴幼儿血管瘤的一线和首选药物[1]。口服盐酸普萘洛尔疗效确切，但其存在首过效应强、生物利用度低、半衰期短等问题，且不良反应发生率高[2]。普通盐酸普萘洛尔外用制剂只对浅表型血管瘤有效，对深部型和复合型血管瘤的治疗仍需结合口服给药。诸多研究表明，立方液晶（cubosomes，Cubs）可显著提高经皮给药制剂的皮肤渗透性，且能提高其在皮肤尤其是皮肤真皮层的药物滞留量，有望能提高盐酸普萘洛尔外用制剂对深部型和复合型血管瘤的疗效[3~5]。因此，课题组拟基于立方液晶载药技术将盐酸普萘洛尔制备成一种纳米经皮给药制剂，以期能降低或避免口服给药带来的高不良反应发生率，提高盐酸普萘洛尔的治疗效果和患者依从性。前期实验中，课题组筛选了盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒（PPL-Cubs）的制备方法，并通过单因素考察结合星点设计效应面法优化了其最佳处方和制备工艺，结果制得的PPL-Cubs包封率低（约50%），远低于药典规定的80%。立方液晶为多层囊泡结构，类似于多囊脂质体，其可能与脂质体同样存在对水溶性化合物包封率较低的问题。鉴于前期研究表明，盐酸普萘洛尔在不同pH磷酸盐缓冲液下的溶解度存在极大差异，因此，本研究拟在立方液晶常规制备的基础上，引入“pH梯度法”的载药思路，制备PPL-Cubs，以期提高其包封率。
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岛津LC-20AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；DV215CD型分析天平（美国奥豪斯公司）；AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；高压均质机（意大利NIRO-SAVI S.P.A.公司）；NICOMP 380 ZLS激光粒度测定仪（美国PSS粒度仪公司）；超滤离心管（100KD，Millipore）。
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盐酸普萘洛尔（含量99.9%，常州亚邦制药有限公司）；单油酸甘油酯（法国GATTEFOSSé公司）；泊洛沙姆407（德国BASF公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
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取PPL-Cubs适量，装入超滤离心管中，于4000 r/min离心10 min，收集离心液，采用课题组前期建立的盐酸普萘洛尔含量测定方法测定离心液中游离药物浓度C游离；取未透析的PPL-Cubs，测定药物浓度C总；根据公式EE（%）=[(C总−C游离)/ C总]×100%计算PPL-Cubs的包封率。
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精密称取单油酸甘油酯9 g和泊洛沙姆407 1.5 g，加入10 ml无水乙醇，20 ℃水浴下搅拌溶解，为A相；精密称取盐酸普萘洛尔3.5 g，加入86 g纯化水，20 ℃水浴下搅拌溶解，为B相。于20 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢地滴加至B相中，待磁力搅拌1 h后加入适量纯化水使总质量为100 g，再在800 bar压力下高压均质7次，得PPL-Cubs。
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精密称取单油酸甘油酯适量，40 ℃水浴加热使融化，为A相；精密称取泊洛沙姆407适量，加入适量纯化水，40 ℃水浴加热使溶解，并用1%磷酸溶液调节pH至酸性，为B相；于40 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢滴加到B相中，待磁力搅拌30 min后，得空白立方液晶纳米粒粗品；取空白立方液晶纳米粒粗品，高压均质数次，得空白立方液晶纳米粒（B-Cubs）。取盐酸普萘洛尔溶解于适量纯化水中，得盐酸普萘洛尔水溶液；将盐酸普萘洛尔水溶液加入一定比例的B-Cubs中，搅拌均匀，并用氢氧化钠溶液调节pH至一定值，于一定温度下持续搅拌一定时间，再放置至室温，即得PPL-Cubs。
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前期试验结果表明，磁力搅拌速度、时间、温度、内水相pH值对B-Cubs的粒径基本无影响，高压均质压力及均质次数是影响其粒径的主要因素，故拟进一步优化高压均质压力和均质次数。
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按照“2.2.2”项下方法，取空白立方液晶纳米粒粗品，分别在400、600、800、900、1000 bar下高压均质7次，测定制得B-Cubs的粒径及多分散指数（见表1）。结果表明，随高压均质压力的提高，制得B-Cubs的粒径和多分散指数均逐渐减小，当均质压力≥900 bar时，B-Cubs的粒径和多分散指数变化较小，故确定高压均质压力为900 bar。
表 1 高压均质压力的考察（n=3）
压力（bar） 粒径（nm） 多分散指数 400 169.1±3.5 0.189±0.056 600 129.9±3.2 0.172±0.062 800 110.9±2.7 0.126±0.041 900 97.9±2.1 0.073±0.016 1000 96.4±1.9 0.057±0.009 -
按照“2.2.2”项下方法，取空白立方液晶纳米粒粗品，分别在900 bar下高压均质3、5、7、9次，测定制得B-Cubs的粒径及多分散指数（见表2）。结果表明，随高压均质次数的增加，制得B-Cubs的粒径和多分散指数均逐渐减小，当均质次数≥7次时，B-Cubs的粒径和多分散指数变化较小，故确定高压均质次数为7次。
表 2 高压均质次数的考察（n=3）
次数（次） 粒径（nm） 多分散指数 3 160.4±4.6 0.173±0.052 5 129.2±3.8 0.140±0.037 7 97.9±2.1 0.073±0.016 9 93.3±1.7 0.067±0.011 -
基于优化的B-Cubs最佳制备工艺，按照“2.2.2”项下方法，固定泊洛沙姆407用量为5%，内水相pH为3.0，考察单油酸甘油酯用量（15%、20%、25%、30%、35%）对制得B-Cubs粒径及多分散指数的影响（见表3）。结果表明，随单油酸甘油酯用量的增加，制得的B-Cubs粒径呈先减小后增大趋势，多分散指数则不断降低，当单油酸甘油酯用量为25%时，制得的B-Cubs具有最小的粒径和较适宜的多分散指数，故确定单油酸甘油酯用量为25%。
表 3 单油酸甘油酯用量的考察（n=3）
用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 137.8±3.4 0.160±0.033 20 119.2±2.9 0.147±0.032 25 97.9±2.1 0.073±0.016 30 118.3±3.5 0.024±0.015 35 150.8±5.4 0.026±0.011 -
基于优化的B-Cubs最佳制备工艺，按照“2.2.2”项下方法，固定单油酸甘油酯用量为25%，内水相pH为3.0，考察泊洛沙姆407用量（3%、4%、5%、6%、7%）对制得B-Cubs粒径及多分散指数的影响（见表4）。结果表明，制得的B-Cubs粒径随泊洛沙姆407用量的增加逐渐降低，多分散指数变化无明显规律，但均较小（<0.1）；当泊洛沙姆407用量≥5%时，粒径变化幅度降低，故确定泊洛沙姆407用量为5%。
表 4 泊洛沙姆407用量的考察（n=3）
用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 3 143.6±3.5 0.064±0.019 4 116.7±3.2 0.055±0.015 5 97.9±2.1 0.073±0.016 6 91.3±1.9 0.052±0.015 7 83.2±1.8 0.062±0.021 -
根据前期盐酸普萘洛尔在不同pH的PBS中溶解度测定结果可知（见表5），盐酸普萘洛尔在pH≥8.5时溶解度显著下降。按照“2.2.2”项下方法，制备内水相pH为3.0的B-Cubs，并按载体/药物比（以单油酸甘油酯/盐酸普萘洛尔计）为6∶1的比例与B-Cubs和盐酸普萘洛尔水溶液进行混合，以10%氢氧化钠溶液分别调节外水相pH至7.5、8.0、8.5、9.0，于20 ℃水浴（载药温度）下600 r/min磁力搅拌15 min（载药时间），制得PPL-Cubs中药物浓度为1%，测定对包封率等参数影响（见表6）。结果表明，PPL-Cubs的包封率随外水相pH值的提高逐渐增加，当外水相pH值≥8.5时，包封率增加趋势渐小；外水相pH值对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 5 盐酸普萘洛尔在不同pH PBS中的溶解度（n=3）
pH 溶解度（mg/ml） 4.5 53.50±4.22 5.5 51.70±2.34 6.5 52.60±1.53 7.5 49.80±2.14 8.5 8.50±1.15 9.5 1.41±0.33 10.5 0.87±0.08 表 6 外水相pH值的考察（n=3）
pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 7.5 71.29±2.58 96.8±2.6 0.063±0.012 8.0 86.24±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 8.5 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 9.0 94.58±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察内水相pH（3.0、4.0、5.0、6.0）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表7）。结果表明，不同内水相pH的B-Cubs对制得的PPL-Cubs包封率无明显差异，对PPL-Cubs的粒径和多分散指数亦无明显影响。
表 7 内水相pH值的考察（n=3）
pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 3.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 4.0 91.85±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 5.0 91.62±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 6.0 89.33±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载体/药物（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表8）。结果表明，当载体/药物≥6时，PPL-Cubs的包封率不再增加；载体/药物比值对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 8 载体/药物的考察（n=3）
载体/药物 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 5∶1 90.93±1.52 98.5±2.7 0.076±0.015 6∶1 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 7∶1 92.06±2.37 97.5±2.1 0.077±0.015 8∶1 92.41±2.58 98.1±2.4 0.102±0.025 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载药温度（20、30、40、50 ℃）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表9）。结果表明，载药温度对PPL-Cubs的包封率、粒径和多分散指数无明显影响。
表 9 载药温度的考察（n=3）
载药温度（℃） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 20 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 91.05±1.95 96.9±2.3 0.068±0.021 40 91.38±2.08 97.1±2.6 0.066±0.012 50 90.55±1.75 97.2±2.1 0.053±0.018 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载药时间（15、30、45、60 min）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表10）。结果表明，载药时间对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 10 载药时间的考察（n=3）
载药时间（min） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 92.09±1.54 97.2±2.4 0.071±0.013 45 92.01±2.01 97.5±1.6 0.065±0.024 60 91.86±1.86 98.1±1.9 0.075±0.026 -
通过调整高压均质压力，制备不同粒径B-Cubs。按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5，分别考察B-Cubs粒径和多分散指数对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表11）。结果表明，B-Cubs的粒径和多分散指数不影响所制得PPL-Cubs的包封率，但B-Cubs的粒径和多分散指数基本决定了制得PPL-Cubs的粒径和多分散指数。
表 11 B-Cubs粒径和多分散指数的考察（n=3）
载体 EE（%） PPL-Cubs 粒径（nm） 多分散指数 粒径（nm） 多分散指数 97.9±2.1 0.073±0.016 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 129.2±3.8 0.140±0.037 91.87±1.96 128.5±2.1 0.123±0.021 160.4±4.6 0.173±0.052 91.85±2.13 158.2±2.8 0.152±0.037 210.5±5.9 0.182±0.057 91.25±2.53 209.2±2.9 0.174±0.045 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5，分别考察药物浓度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表12）。结果表明，随着PPL-Cubs中药物浓度的提高，包封率呈逐渐增加趋势，当药物浓度≥1%时，包封率增加趋势变慢。
表 12 PPL-Cubs中药物浓度的考察（n=3）
浓度 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 0.1 51.83±3.17 97.2±2.4 0.057±0.013 0.5 81.87±2.12 96.3±2.1 0.062±0.012 1.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 2.0 94.42±1.37 96.3±1.9 0.045±0.005 3.0 95.87±1.28 97.8±2.5 0.042±0.007 -
精密称取单油酸甘油酯25.0 g，40 ℃水浴加热使融化，为A相；精密称取泊洛沙姆407 5.0 g，加入70 g纯化水，40 ℃水浴加热使溶解，并用1%磷酸溶液调节pH至3.0，为B相；于40 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢滴加到B相中，待磁力搅拌30 min后，再在900 bar下高压均质7次，得B-Cubs。取盐酸普萘洛尔1 g，溶解于适量纯化水中，得盐酸普萘洛尔水溶液；将盐酸普萘洛尔水溶液加入24 g B-Cubs中，搅拌均匀，用10%氢氧化钠溶液调节pH至8.5，于20 ℃水浴持续搅拌15 min，再放置至室温，即得PPL-Cubs
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立方液晶纳米粒常用的制备方法包括注入法、熔融-分散法、热处理法、喷雾干燥法等[6]。试验前期以粒径、包封率等为评价指标筛选了最佳制备方法为注入法，并优化了其最佳处方制备工艺，结果制得的载药立方液晶纳米粒包封率较低（约50%）[7]。立方液晶是两亲性脂质分子分散在过量水中形成的含双连续水区和闭合脂质双分子层的蜂窝状液晶结构；水溶性分子被包封于立方液晶水道中，脂溶性分子被包封于脂质双层膜中，两亲性分子则贯穿其中。盐酸普萘洛尔在酸性环境下具有较高的溶解性，常规方法制得的盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒pH约为3.5，如何让其具有进入立方液晶载体内相的“动力”是提高载药立方液晶纳米粒包封率的关键。因此，本研究引入“pH梯度法”，通过创造高溶解度内环境（低pH值内水相）和低溶解度外环境（高pH值外水相），给盐酸普萘洛尔提供进入立方液晶载体内相的“动力”。离子化的盐酸普萘洛尔在调节pH的过程中逐渐变为分子形态的普萘洛尔而进入脂质区，脂质区的普萘洛尔分子接触内水相酸性环境而被离子化，内水相中离子化的盐酸普萘洛尔无法再通过脂质区而被捕获于内水相。结果表明，pH梯度法显著提高了PPL-Cubs的包封率，包封率达到90%。
Preparation of propranolol hydrochloride cubosomes by pH gradient method
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摘要:
目的 制备具有较高包封率的盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒（PPL- Cubs）。 方法 采用pH梯度法制备PPL-Cubs；以粒径、多分散指数为评价指标，优化空白立方液晶纳米粒（B-Cubs）制备的高压均质压力、高压均质次数、单油酸甘油酯用量及泊洛沙姆407用量；以包封率等为评价指标，优化外水相pH值、内水相pH值、载体/药物比、载药温度、载药时间、B-Cubs粒径和多分散指数、药物浓度等。 结果 高压均质压力为900 bar、均质次数为7次、单油酸甘油酯用量为25%、泊洛沙姆407用量为5%时，制得的B-Cubs具有较小的粒径和多分散指数。外水相pH值为8.5、内水相pH值为3.0、载体/药物比为6∶1、载药温度为20 ℃、载药时间为15 min、药物浓度为1%时，制得的PPL-Cubs包封率较高；B-Cubs粒径和多分散指数对制得的PPL-Cubs包封率无明显影响。 结论 pH梯度法能制得较高包封率的盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒。 Abstract:Objective To prepare propranolol hydrochloride loaded cubosomes (PPL-Cubs) with high entrapment efficiency. Methods PPL-Cubs was prepared by pH gradient method. Pressure and cycles of high pressure homogenization, dosage of glyceryl monooleate and poloxamer 407 were optimized to prepare blank cubosomes with particle size and polydispersity index as the indexes. The influences of various factors, including exterior pH values, internal pH values, the ratio of carrier to drug, particle size and polydispersity index of blank cubosomes, incubation temperature and time, and drug concentration on the entrapment efficiency were investigated. Results The blank cubosomes with small particle size and polydispersity index was prepared under homogenization conditions of 900 bar for 7 cycles, glyceryl monooleate dosage of 25%, and poloxamer 407 dosage of 5%. PPL-Cubs showed high entrapment efficiency with exterior pH value of 8.5, internal pH value of 3.0, ratio of carrier to drug of 6∶1, incubation temperature of 20 ℃, and incubation time of 15 min, and drug concentration of 1%. The particle size and polydispersity index of blank cubosomes showed no influence on entrapment efficiency. Conclusion PPL-Cubs with high entrapment efficiency could be prepared under the pH gradient method. -
Key words:
- propranolol hydrochloride /
- cubosomes /
- pH gradient method
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银黄软胶囊是一种清热、解毒、消炎作用的中成药。因中药起效慢、副作用少，一些不良商家为了寻求暴利，在中成药中添加西药成分，短时间内提高中成药的疗效，误导消费者以寻求高利润。因双氯芬酸钠有消炎镇痛作用、芬布芬有抗炎作用、盐酸罗通定有镇痛作用，就成了不良商家非法添加的成分之列，据报道有30%的抗风湿类健康产品中非法添加了双氯芬酸钠[1]，多种抗风湿镇痛类中药制剂中非法添加双氯芬酸钠、芬布芬等此类化学药物[2]。因此，建立一种快速有效的检测方法，对可能非法添加了西药成分的中成药进行现场检测具有重要的意义。
近几年，薄层色谱-表面增强拉曼光谱（TLC-SERS）联用技术广泛地应用于各种领域[3-4]，尤其是在药物非法添加研究领域被逐渐认可[5-8]。本研究应用TLC-SERS联用技术，探索双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定在中成药银黄软胶囊中非法添加的鉴别方法，以期为进一步的中成药快速检验提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1 仪器与试药
便携式拉曼光谱仪（BWS415，B&W Tek Inc., U.S.A），激光发射波长785 nm，分辨率5 cm–1；WFH-203B型三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；离心机（TG16-WS，上海卢湘仪离心机有限公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；薄层板HSGF254（烟台市化学工业研究所）。
双氯芬酸钠（批号：100334-200302，供含量测定用）、芬布芬（批号：100415-201102，纯度99.4%）、盐酸罗通定（批号：100222-200702，供鉴别用）均购自中国食品药品检定研究院。实验所用阴性样品由山东省食品药品检验所提供，银黄软胶囊（批号：359161004，石药集团欧意药业有限公司）。乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150410）、石油醚（天津市富宇精细化工有限公司，批号：12589-2007）；硝酸银（批号：20140320，国药集团化学试剂有限公司），柠檬酸钠（分析纯，批号：20120429，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为蒸馏水。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液的制备
对照品溶液：精密称取对照品双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定对照品2 mg，置EP管中，加入甲醇2 ml溶解，制成浓度为1 mg/ml的溶液，作为对照品溶液，冷藏保存，备用。
模拟假阳性样品溶液：取中成药银黄软胶囊（经山东省食品药品检验院薄层色谱-质谱联用法检测，不含以上3种对照品，可作为阴性样品）一次剂量，置EP管中，并精密量取双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定对照品溶液加入EP管中，与银黄软胶囊样品溶液混匀，甲醇溶解，振荡，超声（40 kHz，250 W）30 min，10 000 r/min离心10 min，收集上清液，微孔滤膜滤过，作为假阳性样品，冷藏保存，备用。
阴性样品溶液：取中成药银黄软胶囊一次剂量，置EP管中，加入甲醇2 ml溶解，振荡，超声（40 kHz，250 W）30 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，微孔滤膜滤过，作为阴性样品，冷藏保存，备用。
1.2.2 纳米银胶溶液的制备
精密称取45 mg的硝酸银，加入少量去离子水使其溶解。溶解后移至250 ml的容量瓶中，用去离子水定容。用电磁搅拌加热器不断搅拌并将其加热至微沸，逐滴加入5 ml浓度为1 %柠檬酸钠溶液并继续加热，保持微沸60 min，继续搅拌至溶液冷却，得灰绿色银溶胶，避光保存[8]。
1.2.3 最佳光谱条件的优选
分别取1 mg/ml双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定对照品溶液，以点样点胶比为变量，激光功率，积分时间为定值，检测出峰效果，筛选3种成分的最佳点样点胶比；同理筛选3种成分的最佳激光功率、积分时间。
1.2.4 检测限的考察
以对照品溶液与阴性样品溶液作为对照，将配制的添加不同浓度对照品的模拟阳性样品点在同一块硅胶薄层板上，按优选的最佳光谱条件设置点样点胶比、激光功率、积分时间，根据信噪比（S/N=3）评价出峰效果，确定各个对照品的检测限。
1.2.5 表面增强拉曼光谱检测
将配置好的各种样品、对照品溶液置于薄曼联用仪内对应位置，高效硅胶薄层板置于仪器平台上，设置点样量与点样位置，由联用仪完成点样操作。取出点样后的薄层板，以选定的石油醚-乙酸乙酯（3:5）展开系统，室温下展开80 mm，取出晾干，放回联用仪，于内置254 nm紫外灯下检视定位以确定点胶位置，设置合适的点胶量、激光强度与积分时间，由联用仪完成点胶操作后，随即进行拉曼检测。
2. 结果
2.1 最佳出峰条件的筛选结果
对照品双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定最佳出峰条件分别是：双氯芬酸钠点样点胶比2:3，激光功率30%，积分时间30 s；芬布芬点样点胶比2:2，激光功率40%，积分时间30 s；盐酸罗通定点样点胶比1:2，激光功率50%，积分时间30 s。拉曼图谱如图1所示。
2.2 检测限的考察结果
从图2、图3、图4中可以看出，3种对照品在薄层色谱中分离程度高，双氯芬酸钠的比移植（Rf）值为0.75，芬布芬Rf值为0.54，盐酸罗通定Rf值为0.21。由“2.1”项可知，双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定最佳点样点胶比分别为2:3、2:2、1:2（即点样量分别为2 μl、2 μl、1 μl，故银黄软胶囊中添加的双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定最低检测限对应的点样沉积量分别为0.2 μg、0.2 μg、0.1 μg。
图 2 双氯芬酸钠薄层及各斑点拉曼光谱1.1 mg/ml双氯芬酸钠；2.添加1 mg/ml双氯芬酸钠；3.添加0.1 mg/ml双氯芬酸钠；4.添加0.01 mg/ml双氯芬酸钠；5.阴性样品
图 3 芬布芬薄层及各斑点拉曼光谱1.1 mg/ml芬布芬；2.添加1 mg/ml芬布芬；3.添加0.1 mg/ml芬布芬；4.添加0.01 mg/ml芬布芬；5.阴性样品
图 4 盐酸罗通定薄层及各斑点拉曼光谱1.1 mg/ml盐酸罗通定；2.添加1 mg/ml盐酸罗通定；3.添加0.1 mg/ml盐酸罗通定；4.添加0.01 mg/ml盐酸罗通定；5.阴性样品2.3 模拟的假阳性样品考察结果
从图5薄层板中可以看出，同时添加了3种对照品的银黄软胶囊模拟的假阳性样品溶液4、5、6、7号中出现了与双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定相同Rf值的斑点，可初步确定4、5、6、7中添加了双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定。为进一步确证，对各斑点进行SERS检测，在拉曼仪数据处理系统中与相应对照品色谱斑点的SERS光谱进行比对，结果表明4、5、6、7号中对应斑点的SERS图谱与双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定对照品的SERS图谱相同，见图5中SERS图谱。
图 5 模拟假阳性样品薄层及拉曼光谱1.双氯芬酸钠；2.芬布芬；3.盐酸罗通定；4-7.添加以上3种成分的银黄软胶囊A.4-7号样品中双氯芬酸钠光谱峰B. 4-7号样品中芬布芬光谱峰C. 4-7号样品中盐酸罗通定光谱峰2.4 3种成分的拉曼光谱分析
由图6可知，双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定3种成分的分子结构中均含有苯环、C—C、C=O基团，故3种成分的拉曼光谱特征峰有9个共有峰，在576、712、1 004、1 130、1 240、1 316、1 394、1 454、1 564 cm–1左右，同一共有峰的强度有所不同，取代基不同拉曼位移略有变化（见表1）。此外，由于3种成分的分子结构含有不同的基团，也有相应的差异峰，如740 cm–1为盐酸罗通定特有峰。共有峰、差异峰以及峰强度共同组成了区别于其他成分的特征峰群，这为TLC-SERS专属性鉴别提供了依据。
表 1 3种成分的拉曼光谱特征峰(cm–1)成分 特征峰 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 双氯芬酸钠 390 576 712 854 1 004 1 130 1 162 1 238 1 316 1 394 1 454 1 570 – 芬布芬 384 576 712 854 1 004 1 130 1 240 1 276 1 316 1 394 1 454 1 564 – 盐酸罗通定 394 576 712 740 1 005 1 132 1 168 1 240 1 278 1 320 1 395 1 456 1 564 3. 讨论
本研究通过反复试验，确定了TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯（3:5），得到了较好的展开效果。在展开的TLC薄层板上，3种对照品对应的斑点处，模拟假阳性样品与3种对照品有相同斑点；经过进一步的SERS检测，模拟假阳性样品的斑点拉曼光谱特征峰与对照品斑点拉曼光谱特征峰一致，且重复性良好，说明TLC-SERS联用技术简便、准确、可靠，可同时检测银黄软胶囊中非法添加的双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定3种成分。
本研究采用TLC-SERS联用技术所建立的检测方法，对中成药银黄软胶囊中非法添加西药双氯芬酸钠、芬布芬、盐酸罗通定3种成分的，能满足同时、快速检测的要求。该方法实用性强，对人员技术要求低，尤其适合现场快速检测。
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表 1 高压均质压力的考察（n=3）
压力（bar） 粒径（nm） 多分散指数 400 169.1±3.5 0.189±0.056 600 129.9±3.2 0.172±0.062 800 110.9±2.7 0.126±0.041 900 97.9±2.1 0.073±0.016 1000 96.4±1.9 0.057±0.009 
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表 2 高压均质次数的考察（n=3）
次数（次） 粒径（nm） 多分散指数 3 160.4±4.6 0.173±0.052 5 129.2±3.8 0.140±0.037 7 97.9±2.1 0.073±0.016 9 93.3±1.7 0.067±0.011
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表 3 单油酸甘油酯用量的考察（n=3）
用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 137.8±3.4 0.160±0.033 20 119.2±2.9 0.147±0.032 25 97.9±2.1 0.073±0.016 30 118.3±3.5 0.024±0.015 35 150.8±5.4 0.026±0.011
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表 4 泊洛沙姆407用量的考察（n=3）
用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 3 143.6±3.5 0.064±0.019 4 116.7±3.2 0.055±0.015 5 97.9±2.1 0.073±0.016 6 91.3±1.9 0.052±0.015 7 83.2±1.8 0.062±0.021
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表 5 盐酸普萘洛尔在不同pH PBS中的溶解度（n=3）
pH 溶解度（mg/ml） 4.5 53.50±4.22 5.5 51.70±2.34 6.5 52.60±1.53 7.5 49.80±2.14 8.5 8.50±1.15 9.5 1.41±0.33 10.5 0.87±0.08
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表 6 外水相pH值的考察（n=3）
pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 7.5 71.29±2.58 96.8±2.6 0.063±0.012 8.0 86.24±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 8.5 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 9.0 94.58±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006
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表 7 内水相pH值的考察（n=3）
pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 3.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 4.0 91.85±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 5.0 91.62±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 6.0 89.33±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006
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表 8 载体/药物的考察（n=3）
载体/药物 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 5∶1 90.93±1.52 98.5±2.7 0.076±0.015 6∶1 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 7∶1 92.06±2.37 97.5±2.1 0.077±0.015 8∶1 92.41±2.58 98.1±2.4 0.102±0.025
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表 9 载药温度的考察（n=3）
载药温度（℃） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 20 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 91.05±1.95 96.9±2.3 0.068±0.021 40 91.38±2.08 97.1±2.6 0.066±0.012 50 90.55±1.75 97.2±2.1 0.053±0.018
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表 10 载药时间的考察（n=3）
载药时间（min） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 92.09±1.54 97.2±2.4 0.071±0.013 45 92.01±2.01 97.5±1.6 0.065±0.024 60 91.86±1.86 98.1±1.9 0.075±0.026
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表 11 B-Cubs粒径和多分散指数的考察（n=3）
载体 EE（%） PPL-Cubs 粒径（nm） 多分散指数 粒径（nm） 多分散指数 97.9±2.1 0.073±0.016 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 129.2±3.8 0.140±0.037 91.87±1.96 128.5±2.1 0.123±0.021 160.4±4.6 0.173±0.052 91.85±2.13 158.2±2.8 0.152±0.037 210.5±5.9 0.182±0.057 91.25±2.53 209.2±2.9 0.174±0.045
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表 12 PPL-Cubs中药物浓度的考察（n=3）
浓度 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 0.1 51.83±3.17 97.2±2.4 0.057±0.013 0.5 81.87±2.12 96.3±2.1 0.062±0.012 1.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 2.0 94.42±1.37 96.3±1.9 0.045±0.005 3.0 95.87±1.28 97.8±2.5 0.042±0.007
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