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红茴香注射液是由红茴香根皮经提取制成的灭菌水溶液，具有消肿散瘀，活血止痛作用。临床用于腰肌劳损，关节或肌肉韧带伤痛等。总黄酮是红茴香注射液的主要成分。原标准以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定总黄酮的量，专属性不强。故笔者参考《中国药典》[1] ，以槲皮苷为测定对象，采用HPLC法测定红茴香注射液中槲皮苷的含量[2-5]获得满意结果, 现报告如下。
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Agilent 1100系列型高效液相色谱仪；HP-Chemstation色谱工作站。
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乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。槲皮苷对照品由中国药品生物制品检定所提供 (批号：111538-200301，含量测定用), 红茴香注射液由浙江泰康药业有限公司提供(批号：20040730)。
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色谱柱为Dikma C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(25∶75)，流速1.0 ml/min，柱温 30 ºC，检测波长256 nm，进样量为10 μl。色谱柱的理论塔板数按槲皮苷峰计算大于3 000。
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精密称取槲皮苷对照品(120 ℃减压干燥至恒重)适量, 加甲醇制成每1 ml含0.1 mg 的溶液, 摇匀, 即得。
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精密吸取本品3 ml，置25 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取滤液作为供试品溶液。
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取辅料作为缺样空白样品，按“2.2.2”项下方法制备。
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分别取阴性对照溶液，对照品溶液及供试品溶液适量，滤过取续滤液 10 μl 注入 HPLC 仪，分别记录色谱图。实验结果表明，该方法专属性良好，阴性对照无干扰，结果见图1。
图 1 红茴香注射液HPLC图
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精密称取经减压干燥24 h的槲皮苷对照品适量，加甲醇配成每l ml含槲皮苷0.215 0 mg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，以槲皮苷峰面积的积分值为Y，进样量为X(μg)，回归得线性方程Y=1 515.9X+57.088 2，r=0.999 8，表明在0.215～3.225 μg范围内呈良好线性关系。
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取同一批供试品6份（批号：20040730），分别按供试品溶液制备法制备，按“2.1”项色谱条件测定。结果表明含量值分别为：1.187、1.189、1.197、1.196、1.196、1.198 mg/ml，RSD为0.40%（n=6），表明此方法重复性较好。
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精密吸取同一供试品溶液（批号：20040730）10 μl，重复进样6次, 按“2.1”项下色谱条件测定。峰面积分别为2 214.51、2 217.06、2 232.75、2 236.86、2 250.09、2 190.69，RSD为0.86%（n=6），结果表明仪器精密度良好。
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精密吸取同一批号供试品溶液（批号：20040730）10 μl，分别于0、0.5、1、2、8、12、24 h测定峰面积值，结果为2 220.96、2 223.36、2 230.08、2 235.78、2 246.88、2 200.44、2 227.17，平均峰面积为2 226.38，RSD为0.64%（n=6），结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
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取已测定含量的样品6份，每份3 ml，分别加入槲皮苷对照品溶液10 ml（浓度为0.225 4 mg/ml），按供试品溶液的制备方法操作，进行回收率测定，结果分别为100.49%、99.33%、98.14%、99.82%、98.89%、99.65%，平均加样回收率为99.39%，RSD为0.82%（n=6）。
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分别取3批不同批号的红茴香注射液样品，按“2.2”项下制备供试品溶液，样品测定结果见表1。
表 1 样品含量测定结果（mg/ml）
批号 槲皮苷 平均含量 20040730 1.194 1.191 20040824 1.186 20041222 1.192 -
取对照品溶液依法操作，在200～400 nm的波长范围内扫描，结果在256.6 nm处有最大吸收，因此选择256 nm作为测定波长(图2)。
图 2 槲皮苷对照品紫外扫描图
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槲皮苷易溶于甲醇、乙醇, 用甲醇作溶剂的峰形比用乙醇作溶剂的峰形好, 因此选择用甲醇作为溶剂。
Quantitative determination of quercetin in Honghuixiang injection by HPLC
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摘要:
目的 建立高效液相色谱法测定红茴香注射液中槲皮苷的含量。 方法 色谱柱为Dikma C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈−0.1%磷酸水溶液（25∶75）为流动相，流速为1.0 ml/min，柱温30 ℃，检测波长为256 nm。 结果 槲皮苷在0.215～3.225 μg范围内呈良好线性关系，相关系数为0.999 6，该法的平均回收率为99.39%，RSD为0.82%（n=6），重复性为1.194 mg/ml，RSD为0.40%。 结论 3批红茴香注射液的槲皮苷平均含量结果为1.191 mg/ml，该法简便、快速、准确, 可作为测定红茴香注射液中槲皮苷含量的方法。 Abstract:Objective To establish quantitative methods to assay quercetin in Honghuixiang injection by HPLC. Methods Dikma C18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used for the assay with acetonitrile −0.1% phosphoric acid (25∶75) as the mobile phase. Flow rate was 1.0 ml/min. The column temperature was 30 ℃. The detection wavelength was at 256 nm. Results Quercetin showed good linear relationship within the range of 0.2150–3.225 μg. The correlation coefficient was 0.999 6. The average recovery was 99.39% with RSD 0.82% (n=6). The repeatability was 1.194 mg/ml with RSD 0.40%. Conclusion The average quercetin content in three batches of Honghuixiang injection was 1.191 mg/ml. This method is simple, rapid and accurate. It can be used for the determination of quercetin in Honghuixiang injection. -
Key words:
- HPLC /
- Honghuixiang injection /
- quercetin
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[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[S]. 北京: 化学工业出版社, 2005. [2] 邱晓静, 苏文镜. HPLC法测定红茴香注射液中芦丁的含量[J]. 海峡药学, 2008, 20(3):70-71. doi: 10.3969/j.issn.1006-3765.2008.03.031 [3] 王姿媛, 胡惠兰. HPLC法测定哥王药材中的槲皮苷含量[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(7):127-129. [4] 常明泉, 潘涛. HPLC法测定氯定庆溶液中苯甲酸钠的含量[J]. 海峡药学, 2017, 29(3):60-62. doi: 10.3969/j.issn.1006-3765.2017.03.021 [5] 董丹华, 刘玉军. HPLC法测定圣愈汤冻干粉中4个指标成分的含量[J]. 中国药房, 2020, 31(5):576-580. doi: 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.05.14 -
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图(2) / 表(1)
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