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大黄为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L.）、唐古特大黄（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或药用大黄（Rheum officinale Bail1.）的干燥根和根茎，用于实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、痈肿疔疮、肠痈腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、跌打损伤、湿热痢疾、黄疸尿赤、淋证、水肿以及外治烧烫伤[1]。研究表明，大黄含有蒽醌类、二苯乙烯类、苯丁酮类、多糖类、有机酸类、鞣质和多酚类等化学成分，具有泻下、抗衰老、抗肿瘤、防治心血管系统疾病和降血糖等多种药理作用[2-6]。
大黄主要分布于我国甘肃陇南、临洮、宕县、礼县、武都、华庭、青海海东、玉树、海北、四川阿坝、湖北恩施和重庆奉节等地[7-8]。近年来，大黄市场需求量逐渐增加，野生药材逐渐枯竭，家种大黄已经成为市场主流商品。但由于种植环境、种植技术水平差异较大，导致药材质量参差不齐，建立一套整体、全面的大黄药材质量控制方法尤为重要[9-12]。
本研究收集3种来源的20批大黄样品，建立大黄的HPLC指纹图谱并进行方法学考察。建立了检测大黄中33种禁用农药残留的方法并进行方法学考察，为更充分利用大黄药材资源提供实验基础。
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SHIMADZU 20AT HPLC仪（日本岛津公司）；XS105万分之一分析天平[Mettler-Toledo international trading（Shanghai）co., Ltd.]；电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。Agilent 1260-6470 QQQ三重四极杆质谱仪，Agilent 8890-7000D气相色谱仪-三重串联四极杆质谱仪；LC-SFJ-10型手持高速匀浆机；GIPP型水浴氮吹仪；RG-160AT型离心机；Direct-Q3UV型超纯水机；XS105型电子天平；RE-52A型旋转蒸发仪；Vortex-250OMT型多管旋涡混合仪；WSZ-200A型振荡器。
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芦荟大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110795-202011，纯度：97.5%），大黄素甲醚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110758-201817，纯度：99.2%），大黄酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110796-201922，纯度：99.4%），大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110756-201913，纯度：96.0%），禁用农药混合对照溶液（中国食品药品检定研究院，批号：610020-202202），甲醇为分析纯（杭州高晶精细化工有限公司）；磷酸为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；色谱纯乙腈 、甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。
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20批大黄药材分别采集于甘肃、青海、四川、湖北，大黄药材经嘉兴东方国药饮片股份有限公司朱涛副主任药师鉴定为蓼科大黄属植物掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根和根茎，见表1。
表 1 20批大黄采集信息表
编号 来源 产地 采集时间 1 唐古特大黄 青海海东 2021年9月 2 唐古特大黄 青海海东 2021年9月 3 唐古特大黄 青海玉树 2021年9月 4 唐古特大黄 青海玉树 2021年9月 5 唐古特大黄 青海玉树 2021年9月 6 药用大黄 四川绵阳 2021年9月 7 药用大黄 四川绵阳 2021年9月 8 药用大黄 四川阿坝州 2021年9月 9 药用大黄 湖北恩施州 2021年9月 10 药用大黄 四川阿坝州 2021年9月 11 药用大黄 湖北恩施州 2021年9月 12 药用大黄 四川阿坝州 2021年9月 13 掌叶大黄 甘肃陇南 2021年9月 14 掌叶大黄 甘肃陇南 2021年9月 15 掌叶大黄 甘肃陇南 2021年9月 16 掌叶大黄 甘肃宕县 2021年9月 17 掌叶大黄 甘肃宕县 2021年9月 18 掌叶大黄 甘肃礼县 2021年9月 19 掌叶大黄 甘肃礼县 2021年9月 20 掌叶大黄 甘肃礼县 2021年9月 -
精密称取大黄粉末0.5 g（过四号筛），置具塞锥形瓶中，精密加入25 ml分析纯甲醇，称定重量，水浴加热回流1 h，放冷，用分析纯甲醇补足减失的重量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
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精密称取芦荟大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酚对照品、大黄素对照品适量，加色谱纯甲醇制成每1 ml含芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素各16 μg的混合溶液，摇匀，备用。
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色谱柱：Silversil C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；以色谱纯甲醇为流动相A，以0.1 %磷酸溶液为流动相B，按照表2进行梯度洗脱；流速为1.0 ml/min；检测波长为254 nm；柱温为35 ℃；进样量为10 μl。
表 2 梯度洗脱条件
时间（t/min） 流动相（A） 流动相（B） 0.0 10 90 5.0 25 75 45.0 60 40 60.0 70 30 70.0 80 20 90.0 80 20 90.1 10 90 100.1 10 90 -
（1）空白试验
吸取分析纯甲醇，在“2.1.3”色谱条件下测定，未见干扰。
（2）精密度考察
按“2.1.1”项下方法制备编号为1的掌叶大黄供试品溶液，按“2.1.3”色谱条件，连续进样6 次 ，记录液相色谱图，计算精密度。以9号峰（芦荟大黄素）为参照峰，各共有峰保留时间的RSD值为0.02 %~0.04 %，峰面积的RSD值范围为0.04 %~0.73 %，均小于2 %。表明仪器精密度良好。
（3）稳定性考察
取编号为1的掌叶大黄，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，放置0、2、4、6、8、10、12 h并按“2.1.3”色谱条件进样，以9号峰（芦荟大黄素）为参照峰，各共有峰保留时间的RSD值为0.02 %~0.04 %，峰面积的RSD值范围为0.32 %~1.70 %，均小于2 %，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。
（4）重复性考察
取编号为1的掌叶大黄，按“2.1.1”项下方法制备 6 份供试品溶液，按“2.1.3”色谱条件进样测定，以9号峰（芦荟大黄素）为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD值范围为0.03 %~0.07 %，峰面积的RSD值范围为0.45 %~1.54 %， RSD值均小于2 %，表明该方法重复性良好。
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取不同来源的大黄样品20批（表1），按“2.1”项下方法制备大黄供试品溶液并进样测定，得到20批大黄样品色谱图，图谱显示掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的液相色谱图差异较大，每个来源大黄的色谱图之间差异较小，将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，共标定12个共有特征峰，分别以每个来源样品的色谱图为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，得到3种来源大黄的HPLC对照图谱，见图1～图2。相似度评价结果见表3～表5。大黄样品与其对照指纹图谱的相似度均>0.95，说明同一来源大黄样品的质量比较接近。
图 1 20批大黄叠加指纹图谱
图 2 混合对照品及3种基原大黄对照图谱
表 3 掌叶大黄相似度结果
序号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 对照 S1 1.000 0.969 0.993 0.989 0.980 0.976 0.995 0.986 0.991 S2 0.969 1.000 0.989 0.993 0.993 0.989 0.986 0.993 0.993 S3 0.993 0.989 1.000 0.997 0.993 0.990 0.998 0.998 0.999 S4 0.989 0.993 0.997 1.000 0.997 0.986 0.996 0.996 0.998 S5 0.980 0.993 0.993 0.997 1.000 0.982 0.989 0.994 0.995 S6 0.976 0.989 0.990 0.986 0.982 1.000 0.989 0.993 0.992 S7 0.995 0.986 0.998 0.996 0.989 0.989 1.000 0.996 0.998 S8 0.986 0.993 0.998 0.996 0.994 0.993 0.996 1.000 0.999 对照 0.991 0.993 0.999 0.998 0.995 0.992 0.998 0.999 1.000 表 4 唐古特大黄相似度结果
序号 S1 S2 S3 S4 S5 对照 S1 1.000 0.992 0.987 0.996 0.990 0.996 S2 0.992 1.000 0.992 0.994 0.994 0.997 S3 0.987 0.992 1.000 0.987 0.998 0.996 S4 0.996 0.994 0.987 1.000 0.994 0.997 S5 0.990 0.994 0.998 0.994 1.000 0.998 对照 0.996 0.997 0.996 0.997 0.998 1.000 表 5 药用大黄相似度结果
序号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 对照 S1 1.000 0.984 0.964 0.996 0.978 0.992 0.978 0.996 S2 0.984 1.000 0.912 0.980 0.951 0.994 0.977 0.986 S3 0.964 0.912 1.000 0.975 0.977 0.938 0.941 0.964 S4 0.996 0.980 0.975 1.000 0.987 0.990 0.983 0.998 S5 0.978 0.951 0.977 0.987 1.000 0.976 0.984 0.987 S6 0.992 0.994 0.938 0.990 0.976 1.000 0.990 0.996 S7 0.978 0.977 0.941 0.983 0.984 0.990 1.000 0.991 对照 0.996 0.986 0.964 0.998 0.987 0.996 0.991 1.000 -
根据保留时间比对确定共有指纹峰，对20批大黄HPLC指纹图谱测定结果进行比较分析，确定12个共有指纹峰。通过与对照品的保留时间比对，确定大黄图谱9号峰为芦荟大黄素, 10号峰为大黄素，11号峰为大黄酚，12号峰为大黄素甲醚。
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采用组间联接法，以峰面积为变量，用SPSS 26.0软件对20批大黄进行聚类分析。由聚类分析树状图可知， 20批不同样品可聚为3类，5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类，药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类，药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类。聚类分析树状图见图3。
图 3 大黄样品聚类分析树状图
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参照《中国药典2020年版》四部2341农药残留量测定法测定。
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（1）气相色谱质谱条件
色谱条件：用（50%苯基）-甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（柱长30 m，膜厚度0.25 µm，柱内径0.25 mm）。进样口温度为250 ℃，不分流进样。载气为高纯氦气。进样口为恒压模式，柱前压力为146 kPa。程序升温：设定初始温度为60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min升至160 ℃，再以2 ℃/min的速率升温至230 ℃，最后以15 ℃/min升温至300 ℃，保持6 min。
质谱条件：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电子轰击源，离子源温度250 ℃。碰撞气为氮气。质谱传输接口温度280 ℃。质谱监测模式为多反应监测。
（2）液相色谱质谱条件
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长10 cm，粒径2.6 µm，内径2.1 mm）；以0.1 %甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸铵）为流动相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸铵）（95∶5）为流动相B，按下表6进行梯度洗脱；流速为0.3 ml/min，柱温为40 ℃。
表 6 流动相梯度洗脱程序
时间（t/min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0~1 70 30 1~12 70→0 30→100 12~14 0 100 质谱条件：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式。监测模式为多反应监测。
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（1） 提取
取过三号筛的大黄粉末5 g，精密称定，加1 g氯化钠，立即摇散，再加入50 ml乙腈，匀浆处理2 min（转速不低于12 000 r/min），再至4 000 r/min的离心机中离心，取上清液，剩余沉淀再加50 ml乙腈，匀浆处理1 min，再离心，合并两次提取的上清液，减压浓缩至约5 ml，用乙腈稀释至10 ml，摇匀，即得。
（2）净化
①气相色谱-串联质谱法：量取乙腈：甲苯（3∶1）10 ml过SelectCore GCB/NH2-A固相萃取柱 （500 mg/500 mg/6 ml）（纳谱分析）活化，溶液弃去，精密量取“提取”中制备的供试品溶液2 ml置萃取柱上，待萃取小柱中样品液全部通过，用20 ml乙腈：甲苯（3∶1）洗脱，收集全部洗脱液，40 ℃以下减压回收至近干，用乙腈稀释至2.0 ml，混匀，即得。②高效液相色谱-串联质谱法：量取上述供试品溶液3 ml，通过亲水亲油平衡材料SelectCore HLB-B固相萃取柱（200 mg，6 ml）（纳谱分析）净化，收集全部净化液，即得。
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（1）混合对照品溶液的制备
取已知浓度的禁用农药混合对照品溶液（已标示各相关农药品种的浓度），精密量取1 ml，置20 ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
（2）气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备
精密称取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制溶解并制成每1 ml含l.0 mg的溶液。精密量取适量，加乙腈制成每1 ml含0.1 µg的溶液。
（3）空白基质溶液的制备
取不含农残的空白大黄基质样品，同供试品溶液的制备方法处理，得到空白基质溶液。
（4）基质混合对照溶液的制备
精密量取上述空白基质溶液1.0 ml（6份），置40 ℃水浴氮吹仪上，氮吹浓缩至约0.6 ml，分别加入混合对照品溶液10、20、50、100、150、200 µl，加乙腈稀释至1 ml，混匀，即得。
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（1）气相色谱-串联质谱法
分别精密吸取上述的供试品溶液和基质混合对照溶液各1 ml，分别精密加入内标溶液0.3 ml，混匀过滤，取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1 µl，注入仪器，按内标曲线法计算，即得。
（2）高效液相色谱-串联质谱法
分别精密吸取上述的基质混合对照溶液和供试品溶液各1 ml，精密加入水0.3 ml，混匀过滤，取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1 µl，注入仪器，按外标曲线法计算，即得。
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（1）标准曲线
将33种禁用农药的基质混合溶液，按照“2.3.4”项下方法进行测定，以不同农药的质量浓度为横坐标，对应的响应值为纵坐标，绘制工作曲线。结果表明：33种禁用农药的质量浓度在线性范围内与其对应的响应值呈线性关系，线性参数表见表7。
表 7 线性参数表
农药 测定方法 线性范围（µg/L） 线性回归方程 相关系数 甲胺磷 LC-MS/MS 5.10~102 Y=5 757.95X-9 518.72 0.999 7 涕灭威亚砜 LC-MS/MS 9.95~199 Y=4 925.37X+2 962.42 0.999 2 久效磷 LC-MS/MS 3.00~60 Y=14 184.41X-13 024.63 0.999 6 涕灭威砜 LC-MS/MS 10.20~202 Y=7 266.57X-25 291.33 0.999 8 3-羟基克百威 LC-MS/MS 5.20~104 Y=3 651.39X-9 142.13 0.998 5 硫环磷 LC-MS/MS 3.10~62 Y=7 354.36X-5 852.39 0.999 7 苯线磷亚砜 LC-MS/MS 2.05~41 Y=655.91X-32.39 0.999 8 磷胺 LC-MS/MS 5.15~103 Y=3 005.51X-5 182.82 0.999 0 涕灭威 LC-MS/MS 10.10~202 Y=11 866.99X-36 969.07 0.999 6 甲磺隆 LC-MS/MS 4.85~97 Y=2 297.70X-1 847.56 0.999 1 苯线磷砜 LC-MS/MS 2.00~40 Y=1 208.50X-552.45 0.997 8 克百威 LC-MS/MS 5.05~101 Y=11 404.76X-20 949.40 0.998 8 氯磺隆 LC-MS/MS 5.05~101 Y=894.56X-339.12 0.999 7 甲拌磷亚砜 LC-MS/MS 2.05~41 Y=10 206.115X-5 030.10 0.999 8 胺苯磺隆 LC-MS/MS 5.00~100 Y=4 500.82X-6 147.15 0.998 6 内吸磷 LC-MS/MS 2.10~42 Y=6 926.58X-4 823.80 0.999 3 特丁硫磷 LC-MS/MS 2.00~40 Y=16 908.79X-7 218.66 0.999 8 甲拌磷砜 LC-MS/MS 1.95~39 Y=451.97X-397.40 0.995 4 水胺硫磷 LC-MS/MS 5.05~101 Y=13 593.18X-18 646.43 0.999 7 苯线磷 LC-MS/MS 2.00~40 Y=3 783.93X-1 458.19 0.999 3 灭线磷 LC-MS/MS 2.05~41 Y=6 444.63X-3 624.02 0.999 5 特丁硫磷砜 LC-MS/MS 2.10~42 Y=947.36X+163.48 0.998 7 氯唑磷 LC-MS/MS 1.00~20 Y=11 742.40X-2 819.51 0.999 6 硫线磷 LC-MS/MS 2.00~40 Y=9 943.19X-7 358.47 0.999 3 甲基异柳磷 LC-MS/MS 2.10~42 Y=20 034.52X-18 536.68 0.999 2 地虫硫磷 LC-MS/MS 2.05~41 Y=581.22X-921.56 0.999 5 蝇毒磷 LC-MS/MS 5.05~101 Y=527.96X-760.59 0.999 8 治螟磷 LC-MS/MS 2.05~41 Y=9 943.19X-7 358.47 0.999 3 甲拌磷 LC-MS/MS 2.05~41 Y=353.64X-30.70 0.999 2 杀虫脒 LC-MS/MS 2.10~42 Y=1.947 933X+0.014 093 0.995 3 α-六六六 GC-MS/MS 4.95~99 Y=4.880 537X-0.007 851 0.998 8 特丁硫磷 GC-MS/MS 2.10~42 Y=9.683 112X-0.016 638 0.996 1 β-六六六 GC-MS/MS 4.90~98 Y=4.061 750X-0.031 009 0.997 1 氟甲腈 GC-MS/MS 2.15~43 Y=2.987 868X+0.007 871 0.998 7 γ-六六六 GC-MS/MS 4.70~94 Y=3.840 197X+0.053 611 0.997 2 δ-六六六 GC-MS/MS 4.75~95 Y=5.344 570X-0.013 935 0.998 1 艾氏剂 GC-MS/MS 4.75~95 Y=1.527 440X+0.001 431 0.998 8 甲基对硫磷 GC-MS/MS 1.90~38 Y=3.734 819X+0.029 243 0.999 5 氟虫腈硫化物 GC-MS/MS 2.00~40 Y=5.988 870X+0.002 575 0.997 3 氟虫腈 GC-MS/MS 2.10~42 Y=3.631 274X-0.019 063 0.998 4 对硫磷 GC-MS/MS 2.00~40 Y=1.428 485X-0.010 180 0.999 6 三氯杀螨醇 GC-MS/MS 5.00~100 Y=9.069 256X-0.030 626 0.998 2 α-硫丹 GC-MS/MS 5.20~104 Y=0.695 002X+0.006 066 0.999 4 氟虫腈砜 GC-MS/MS 1.95~39 Y=2.529 407X-0.031 948 0.994 6 4,4'-滴滴伊 GC-MS/MS 4.70~94 Y=11.689 424X-0.043 865 0.999 0 狄氏剂 GC-MS/MS 5.15~103 Y=1.010 844X-0.010 762 0.999 0 除草醚 GC-MS/MS 5.10~102 Y=1.658 219X-0.009 227 0.997 3 2,4'-滴滴涕 GC-MS/MS 4.90~98 Y=12.444 953X-0.117 27 0.998 4 4,4'-滴滴滴 GC-MS/MS 4.75~95 Y=6.152 856X+0.000 8 0.999 6 β-硫丹 GC-MS/MS 4.90~98 Y=0.629 329X-0.002 075 0.998 3 4,4'-滴滴涕 GC-MS/MS 4.75~95 Y=9.002 096X-0.058 095 0.997 6 硫丹硫酸酯 GC-MS/MS 4.85~97 Y=0.579 655X-0.001 658 0.999 7 （2）回收率和重复性实验
以空白大黄样品6份为基质，分别加入混合对照品溶液200 µl到样品中，做加标回收试验，根据实际曲线得到的响应值结果与理论值进行计算33种禁用农药的回收率和回收率的相对标准偏差（RSD）。结果表明：33种禁用农药的平均回收率为62.1%~101.3% ，回收率的 RSD为1.12%~10.26%。结果见表8。
表 8 大黄农药残留检测中33种农药回收率实验
农药 平均回收率（%） RSD（%） 农药 平均回收率（%） RSD（%） 甲胺磷 65.9 1.28 蝇毒磷 65.6 7.45 涕灭威亚砜 77.2 1.93 治螟磷 72.9 3.57 久效磷 76.3 2.02 甲拌磷 64.1 2.63 涕灭威砜 75.6 3.98 杀虫脒 100.8 3.65 3-羟基克百威 76.9 4.55 α-六六六 92.3 4.71 硫环磷 73.5 3.09 特丁硫磷 94.0 5.08 苯线磷亚砜 85.1 5.72 β-六六六 95.2 4.83 磷胺 80.2 3.83 氟甲腈 100.9 4.63 涕灭威 73.2 3.03 γ-六六六 100.2 3.84 甲磺隆 94.4 10.26 δ-六六六 92.6 2.21 苯线磷砜 80.7 5.93 艾氏剂 94.4 4.55 克百威 78.1 3.90 甲基对硫磷 99.9 4.53 氯磺隆 96.5 9.18 氟虫腈硫化物 96.6 4.88 甲拌磷亚砜 75.7 4.21 氟虫腈 94.5 4.09 胺苯磺隆 74.2 6.22 对硫磷 92.1 5.10 内吸磷 64.1 4.68 三氯杀螨醇 87.7 2.80 特丁硫磷 74.9 3.43 α-硫丹 95.6 5.37 甲拌磷砜 84.1 2.74 氟虫腈砜 94.7 3.63 水胺硫磷 78.5 4.23 4,4'-滴滴伊 101.2 4.07 苯线磷 69.6 5.98 狄氏剂 99.9 3.66 灭线磷 68.5 4.04 除草醚 94.2 2.33 特丁硫磷砜 80.5 4.76 2,4'-滴滴涕 101.3 4.73 氯唑磷 73.2 4.82 4,4'-滴滴滴 96.9 1.12 硫线磷 62.1 3.13 β-硫丹 94.2 6.55 甲基异柳磷 72.1 4.60 4,4'-滴滴涕 100.9 3.73 地虫硫磷 65.4 6.17 硫丹硫酸酯 97.0 2.57 -
按照以上前处理方法对20批大黄样品进行测定，检测结果表明禁用农药均未检出。本研究显示该方法快速、高效和准确，可以作为日常药材监管和检验依据，对大黄中农药残留进行安全评估。
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本研究建立了20批不同产地不同种源大黄的指纹图谱，采用指纹图谱软件共标定出12个共有指纹峰。通过与对照品的色谱峰保留时间比对，4个色谱峰得到确认。生成3种不同来源大黄的指纹图谱，每一类大黄与其对照指纹图谱的相似度均大于0.95，说明建立的大黄指纹图谱方法具有较好的稳定性和可控性，能为质量评价提供参考依据。通过聚类分析将20批大黄分为3类，5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类，药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类，药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类，表明大黄药材的内在质量与大黄种属有一定的关联，可能还与产地，海拔，种植环境有关。综上所述，本研究所建立的不同来源大黄指纹图谱准确度高，灵敏度高，专属性强，可以为大黄的质量控制提供可靠依据。同时本研究建立了大黄中33种禁用农药检测方法，结果显示所有大黄样品均未检出禁用农药，风险较小。结果显示，该方法操作简单、重复性好，可用于大黄的禁用农药残留筛查。
HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues
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摘要:
目的 建立不同种大黄的HPLC特征指纹图谱和禁用农药残留检测方法，并综合评价其药材质量。 方法 收集3种大黄共20批，采用HPLC法进行分析，流动相为甲醇-0.1 ％磷酸溶液；梯度洗脱；柱温35 ℃；检测波长254 nm；流速1.0 ml/min；并对结果进行聚类分析。采用直接提取法，并建立HPLC-串联质谱法，气相色谱-串联质谱法，对不同来源、产地大黄的33种禁用农药进行检测。 结果 掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度均>0.95，聚类分析将20批大黄样品分为3类。不同产地的大黄样品均未检出33种禁用农药。 结论 3种大黄药材质量差异较大，建立的HPLC指纹图谱和禁用农残的方法稳定、可靠、简便准确,可以为大黄的质量控制评价提供依据。 Abstract:Objective To establish the HPLC fingerprint and pesticide residue detection methods for different kinds of rhubarb, and evaluate the quality of rhubarb comprehensively. Methods 20 batches of three types of rhubarb were collected and analyzed by high-performance liquid chromatography. The mobile phase was methanol-0.1 % phosphoric acid solution; gradient elution; column temperature of 35 ℃; detection wavelength of 254 nm; flow rate 1.0 ml/min. And cluster analysis was performed on the results. Direct extraction method was used and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-tandem mass spectrometry were established, 33 prohibited pesticides from different sources and origins of rhubarb were detected. Results The similarity among the fingerprint spectra of three sources of rhubarb, namely Rheum palmatum L., Rheum tanguticum Maxim.ex Balf., and Rheum officinale Bail1., and their control fingerprint spectra was>0.95. 20 batches of rhubarb samples were divided into 3 categories by cluster analysis. 33 prohibited pesticides were detected in rhubarb samples from different regions. Conclusion The quality of three kinds of rhubarb was significantly different. The established HPLC fingerprint and the method of banning agricultural residues were stable, reliable, simple and accurate, which could provide a basis for quality control evaluation of rhubarb. -
Key words:
- rhubarb /
- fingerprint /
- forbidden pesticide residues
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表 1 20批大黄采集信息表
编号 来源 产地 采集时间 1 唐古特大黄 青海海东 2021年9月 2 唐古特大黄 青海海东 2021年9月 3 唐古特大黄 青海玉树 2021年9月 4 唐古特大黄 青海玉树 2021年9月 5 唐古特大黄 青海玉树 2021年9月 6 药用大黄 四川绵阳 2021年9月 7 药用大黄 四川绵阳 2021年9月 8 药用大黄 四川阿坝州 2021年9月 9 药用大黄 湖北恩施州 2021年9月 10 药用大黄 四川阿坝州 2021年9月 11 药用大黄 湖北恩施州 2021年9月 12 药用大黄 四川阿坝州 2021年9月 13 掌叶大黄 甘肃陇南 2021年9月 14 掌叶大黄 甘肃陇南 2021年9月 15 掌叶大黄 甘肃陇南 2021年9月 16 掌叶大黄 甘肃宕县 2021年9月 17 掌叶大黄 甘肃宕县 2021年9月 18 掌叶大黄 甘肃礼县 2021年9月 19 掌叶大黄 甘肃礼县 2021年9月 20 掌叶大黄 甘肃礼县 2021年9月 
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表 2 梯度洗脱条件
时间（t/min） 流动相（A） 流动相（B） 0.0 10 90 5.0 25 75 45.0 60 40 60.0 70 30 70.0 80 20 90.0 80 20 90.1 10 90 100.1 10 90
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表 3 掌叶大黄相似度结果
序号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 对照 S1 1.000 0.969 0.993 0.989 0.980 0.976 0.995 0.986 0.991 S2 0.969 1.000 0.989 0.993 0.993 0.989 0.986 0.993 0.993 S3 0.993 0.989 1.000 0.997 0.993 0.990 0.998 0.998 0.999 S4 0.989 0.993 0.997 1.000 0.997 0.986 0.996 0.996 0.998 S5 0.980 0.993 0.993 0.997 1.000 0.982 0.989 0.994 0.995 S6 0.976 0.989 0.990 0.986 0.982 1.000 0.989 0.993 0.992 S7 0.995 0.986 0.998 0.996 0.989 0.989 1.000 0.996 0.998 S8 0.986 0.993 0.998 0.996 0.994 0.993 0.996 1.000 0.999 对照 0.991 0.993 0.999 0.998 0.995 0.992 0.998 0.999 1.000
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表 4 唐古特大黄相似度结果
序号 S1 S2 S3 S4 S5 对照 S1 1.000 0.992 0.987 0.996 0.990 0.996 S2 0.992 1.000 0.992 0.994 0.994 0.997 S3 0.987 0.992 1.000 0.987 0.998 0.996 S4 0.996 0.994 0.987 1.000 0.994 0.997 S5 0.990 0.994 0.998 0.994 1.000 0.998 对照 0.996 0.997 0.996 0.997 0.998 1.000
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表 5 药用大黄相似度结果
序号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 对照 S1 1.000 0.984 0.964 0.996 0.978 0.992 0.978 0.996 S2 0.984 1.000 0.912 0.980 0.951 0.994 0.977 0.986 S3 0.964 0.912 1.000 0.975 0.977 0.938 0.941 0.964 S4 0.996 0.980 0.975 1.000 0.987 0.990 0.983 0.998 S5 0.978 0.951 0.977 0.987 1.000 0.976 0.984 0.987 S6 0.992 0.994 0.938 0.990 0.976 1.000 0.990 0.996 S7 0.978 0.977 0.941 0.983 0.984 0.990 1.000 0.991 对照 0.996 0.986 0.964 0.998 0.987 0.996 0.991 1.000
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表 7 线性参数表
农药 测定方法 线性范围（µg/L） 线性回归方程 相关系数 甲胺磷 LC-MS/MS 5.10~102 Y=5 757.95X-9 518.72 0.999 7 涕灭威亚砜 LC-MS/MS 9.95~199 Y=4 925.37X+2 962.42 0.999 2 久效磷 LC-MS/MS 3.00~60 Y=14 184.41X-13 024.63 0.999 6 涕灭威砜 LC-MS/MS 10.20~202 Y=7 266.57X-25 291.33 0.999 8 3-羟基克百威 LC-MS/MS 5.20~104 Y=3 651.39X-9 142.13 0.998 5 硫环磷 LC-MS/MS 3.10~62 Y=7 354.36X-5 852.39 0.999 7 苯线磷亚砜 LC-MS/MS 2.05~41 Y=655.91X-32.39 0.999 8 磷胺 LC-MS/MS 5.15~103 Y=3 005.51X-5 182.82 0.999 0 涕灭威 LC-MS/MS 10.10~202 Y=11 866.99X-36 969.07 0.999 6 甲磺隆 LC-MS/MS 4.85~97 Y=2 297.70X-1 847.56 0.999 1 苯线磷砜 LC-MS/MS 2.00~40 Y=1 208.50X-552.45 0.997 8 克百威 LC-MS/MS 5.05~101 Y=11 404.76X-20 949.40 0.998 8 氯磺隆 LC-MS/MS 5.05~101 Y=894.56X-339.12 0.999 7 甲拌磷亚砜 LC-MS/MS 2.05~41 Y=10 206.115X-5 030.10 0.999 8 胺苯磺隆 LC-MS/MS 5.00~100 Y=4 500.82X-6 147.15 0.998 6 内吸磷 LC-MS/MS 2.10~42 Y=6 926.58X-4 823.80 0.999 3 特丁硫磷 LC-MS/MS 2.00~40 Y=16 908.79X-7 218.66 0.999 8 甲拌磷砜 LC-MS/MS 1.95~39 Y=451.97X-397.40 0.995 4 水胺硫磷 LC-MS/MS 5.05~101 Y=13 593.18X-18 646.43 0.999 7 苯线磷 LC-MS/MS 2.00~40 Y=3 783.93X-1 458.19 0.999 3 灭线磷 LC-MS/MS 2.05~41 Y=6 444.63X-3 624.02 0.999 5 特丁硫磷砜 LC-MS/MS 2.10~42 Y=947.36X+163.48 0.998 7 氯唑磷 LC-MS/MS 1.00~20 Y=11 742.40X-2 819.51 0.999 6 硫线磷 LC-MS/MS 2.00~40 Y=9 943.19X-7 358.47 0.999 3 甲基异柳磷 LC-MS/MS 2.10~42 Y=20 034.52X-18 536.68 0.999 2 地虫硫磷 LC-MS/MS 2.05~41 Y=581.22X-921.56 0.999 5 蝇毒磷 LC-MS/MS 5.05~101 Y=527.96X-760.59 0.999 8 治螟磷 LC-MS/MS 2.05~41 Y=9 943.19X-7 358.47 0.999 3 甲拌磷 LC-MS/MS 2.05~41 Y=353.64X-30.70 0.999 2 杀虫脒 LC-MS/MS 2.10~42 Y=1.947 933X+0.014 093 0.995 3 α-六六六 GC-MS/MS 4.95~99 Y=4.880 537X-0.007 851 0.998 8 特丁硫磷 GC-MS/MS 2.10~42 Y=9.683 112X-0.016 638 0.996 1 β-六六六 GC-MS/MS 4.90~98 Y=4.061 750X-0.031 009 0.997 1 氟甲腈 GC-MS/MS 2.15~43 Y=2.987 868X+0.007 871 0.998 7 γ-六六六 GC-MS/MS 4.70~94 Y=3.840 197X+0.053 611 0.997 2 δ-六六六 GC-MS/MS 4.75~95 Y=5.344 570X-0.013 935 0.998 1 艾氏剂 GC-MS/MS 4.75~95 Y=1.527 440X+0.001 431 0.998 8 甲基对硫磷 GC-MS/MS 1.90~38 Y=3.734 819X+0.029 243 0.999 5 氟虫腈硫化物 GC-MS/MS 2.00~40 Y=5.988 870X+0.002 575 0.997 3 氟虫腈 GC-MS/MS 2.10~42 Y=3.631 274X-0.019 063 0.998 4 对硫磷 GC-MS/MS 2.00~40 Y=1.428 485X-0.010 180 0.999 6 三氯杀螨醇 GC-MS/MS 5.00~100 Y=9.069 256X-0.030 626 0.998 2 α-硫丹 GC-MS/MS 5.20~104 Y=0.695 002X+0.006 066 0.999 4 氟虫腈砜 GC-MS/MS 1.95~39 Y=2.529 407X-0.031 948 0.994 6 4,4'-滴滴伊 GC-MS/MS 4.70~94 Y=11.689 424X-0.043 865 0.999 0 狄氏剂 GC-MS/MS 5.15~103 Y=1.010 844X-0.010 762 0.999 0 除草醚 GC-MS/MS 5.10~102 Y=1.658 219X-0.009 227 0.997 3 2,4'-滴滴涕 GC-MS/MS 4.90~98 Y=12.444 953X-0.117 27 0.998 4 4,4'-滴滴滴 GC-MS/MS 4.75~95 Y=6.152 856X+0.000 8 0.999 6 β-硫丹 GC-MS/MS 4.90~98 Y=0.629 329X-0.002 075 0.998 3 4,4'-滴滴涕 GC-MS/MS 4.75~95 Y=9.002 096X-0.058 095 0.997 6 硫丹硫酸酯 GC-MS/MS 4.85~97 Y=0.579 655X-0.001 658 0.999 7
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表 8 大黄农药残留检测中33种农药回收率实验
农药 平均回收率（%） RSD（%） 农药 平均回收率（%） RSD（%） 甲胺磷 65.9 1.28 蝇毒磷 65.6 7.45 涕灭威亚砜 77.2 1.93 治螟磷 72.9 3.57 久效磷 76.3 2.02 甲拌磷 64.1 2.63 涕灭威砜 75.6 3.98 杀虫脒 100.8 3.65 3-羟基克百威 76.9 4.55 α-六六六 92.3 4.71 硫环磷 73.5 3.09 特丁硫磷 94.0 5.08 苯线磷亚砜 85.1 5.72 β-六六六 95.2 4.83 磷胺 80.2 3.83 氟甲腈 100.9 4.63 涕灭威 73.2 3.03 γ-六六六 100.2 3.84 甲磺隆 94.4 10.26 δ-六六六 92.6 2.21 苯线磷砜 80.7 5.93 艾氏剂 94.4 4.55 克百威 78.1 3.90 甲基对硫磷 99.9 4.53 氯磺隆 96.5 9.18 氟虫腈硫化物 96.6 4.88 甲拌磷亚砜 75.7 4.21 氟虫腈 94.5 4.09 胺苯磺隆 74.2 6.22 对硫磷 92.1 5.10 内吸磷 64.1 4.68 三氯杀螨醇 87.7 2.80 特丁硫磷 74.9 3.43 α-硫丹 95.6 5.37 甲拌磷砜 84.1 2.74 氟虫腈砜 94.7 3.63 水胺硫磷 78.5 4.23 4,4'-滴滴伊 101.2 4.07 苯线磷 69.6 5.98 狄氏剂 99.9 3.66 灭线磷 68.5 4.04 除草醚 94.2 2.33 特丁硫磷砜 80.5 4.76 2,4'-滴滴涕 101.3 4.73 氯唑磷 73.2 4.82 4,4'-滴滴滴 96.9 1.12 硫线磷 62.1 3.13 β-硫丹 94.2 6.55 甲基异柳磷 72.1 4.60 4,4'-滴滴涕 100.9 3.73 地虫硫磷 65.4 6.17 硫丹硫酸酯 97.0 2.57
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