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大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

毛泽玲 文波

王璐暖, 吴建辉, 何贝轩, 张彦洁, 郭美丽. 羟基红花黄色素A生物合成途径短链还原酶基因的特征及功能研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(3): 218-225. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202201061
引用本文: 毛泽玲, 文波. 大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(7): 297-304, 314. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
WANG Lunuan, WU Jianhui, HE Beixuan, ZHANG Yanjie, GUO Meili. Characterization and function of short-chain dehydrogenases/reductases in hydroxysafflower yellow A biosynthesis pathway[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(3): 218-225. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202201061
Citation: MAO Zeling, WEN Bo. HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(7): 297-304, 314. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057

大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
基金项目: 杭州市卫生科技计划项目(B20210302)
详细信息
    作者简介:

    毛泽玲,主管中药师,研究方向:中药活性成分及质量标准研究,Tel:15757165880,Email:876231359@qq.com

    通讯作者: 文 波,高级工程师,研究方向:中药质量标准研究,Tel:18067998908,Email:wenborin@126.com

HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues

  • 摘要:   目的  建立不同种大黄的HPLC特征指纹图谱和禁用农药残留检测方法,并综合评价其药材质量。  方法  收集3种大黄共20批,采用HPLC法进行分析,流动相为甲醇-0.1 %磷酸溶液;梯度洗脱;柱温35 ℃;检测波长254 nm;流速1.0 ml/min;并对结果进行聚类分析。采用直接提取法,并建立HPLC-串联质谱法,气相色谱-串联质谱法,对不同来源、产地大黄的33种禁用农药进行检测。  结果  掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度均>0.95,聚类分析将20批大黄样品分为3类。不同产地的大黄样品均未检出33种禁用农药。  结论  3种大黄药材质量差异较大,建立的HPLC指纹图谱和禁用农残的方法稳定、可靠、简便准确,可以为大黄的质量控制评价提供依据。
  • 近年来,慢病患病率和死亡率呈持续上升趋势,部分慢病管理现况不容乐观[1-2]。哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)作为常见的慢性呼吸系统疾病,其发病率和死亡率呈上升趋势[3-5]。据流行病学调查统计,COPD在全球人群发病率约10% ,而在我国40岁以上人群患病率高达13.7% ,位居全球死亡原因第三位[6]。支气管哮喘(简称哮喘)目前有近3.58亿人[7] ,亚洲成人哮喘患病率为0.7%~11.9%[3]。按2015年全国人口普查数据推算,我国20岁以上约有4570万人罹患哮喘[8],病死率居全球之首[9] 。随着我国老龄化人口的不断增加,哮喘和COPD 已成为我国疾病防控的重大挑战之一[10]。哮喘和COPD患者长期规范化药物治疗可以帮助患者预防急性发病,改善生活质量,减少医疗费用支出,降低死亡风险。

    药学服务在一定程度上可帮助慢病患者规范药物治疗,逐步实现自我管理。近年来,药物治疗管理被广泛用于临床实践,并成为全球药学服务的主流模式[11]。药物治疗管理其服务对象以慢病患者为主,通过与医师协同工作等方式,对患者的药物治疗和生活方式进行管理。我院结合医院实际,借鉴药物治疗管理模式,以咳喘(哮喘和COPD)患者为服务对象,通过开设咳喘医药联合门诊,探索我院药学服务模式转型及咳喘医药联合门诊的规范化工作模式。

    参考《医疗机构药学门诊服务规范》(2021版)[12],我院对参与咳喘医药联合门诊药师资质进行了严格规定,出诊药师应具有主管药师及以上专业技术职务任职资格、经临床药师规范化培训并获得临床药师岗位培训证书或从事临床药学工作3年及以上;具有副主任药师及以上专业技术职务任职资格、从事临床药学工作2年及以上。且完成咳喘药学规范化培训,并获得《咳喘药学规范化培训结业证书》,掌握咳喘疾病的临床诊断、药物治疗、用药教育等内容,具备咳喘医药联合门诊药物治疗管理能力。此外,出诊药师需定期参加咳喘医药相关培训和学术会议,提高专业技能;并在本单位开展医护人员和患者用药宣讲,提高合理用药意识。

    我院以中国药学会药学服务专业委员会发起的“PCCM(Pulmonary and Critical Care Medicine)咳喘药学服务门诊”项目为依托,结合我院实际,建立了咳喘医药联合门诊。服务对象包括咳喘疾病需长期用药患者、初次使用或使用数种吸入药物患者、高龄或难以正确掌握吸入药物使用方法患者及需要咨询咳喘疾病相关药物信息患者。服务内容包括:咳喘患者治疗方案评估、建立用药记录卡、药物咨询与指导、治疗干预、个体化用药教育、指导吸入制剂正确使用、咨询与指导其他合并用药问题、正确认识疾病、不良反应防范、生活方式指导、定期随访与复诊等。工作流程具体如下:对于首诊患者,收集患者基本信息—对治疗方案进行评估—用药干预—用药教育—核实患者接受度—后期随访。对于非首诊患者,核实患者接受程度—对治疗方案进行评估—用药干预—用药教育—后期随访。

    制作药学服务卡片,帮助药师归整药学服务工作。制作并使用一系列咳喘疾病评估量表,帮助患者了解疾病和药物相关知识;帮助医师、药师评估患者病情严重程度、药物接受度和疗效,为调整治疗方案提供依据。通过加大宣教力度,再次预约就诊和定期电话随访等方式,对比分析患者治疗方案可行性和远期获益。定期归纳总结患者用药过程中易出现的问题,积累实践经验。

    咳喘疾病需长期用药,药物疗效与患者对疾病的认识、吸入装置和其他治疗药物的使用及用药依从性密切相关。药师通过宣教、指导和随访等,帮助患者实现慢病的自我管理。

    选取2021年6月至2021年12月在我院呼吸消化内科咳喘医药联合门诊就诊的110名咳喘患者。纳入标准:符合中华医学会呼吸病学分会的COPD/哮喘的诊断标准,既往有COPD/哮喘反复发作病史,未进行规范化治疗和药学管理,具备基本读写能力,自愿参加本研究的患者。排除标准:处于急性发作期患者;近6个月存在不稳定心绞痛或心肌梗死者;肺癌;合并其他严重脏器疾病;认知障碍或精神类疾病;严重全身性感染。

    本研究中建档患者共110例,其中男性77例,女性33例,年龄22~85岁,年龄中位数为71岁,吸烟人数中男性34人(占30.9%),女性2人(占1.82%),戒烟人数中男性7人(占6.4%),女性0人,肺功能监测患者中男性46人(占41.8%),女性18人(占16.36%)。采取电话随访、定期复诊的方式对患者进行3个月的药学干预,有效回访的患者有68例。

    2.2.1   填写基本信息登记表

    对符合入组标准的患者进行建档管理,填写《咳喘药学服务门诊用药服务卡》,收集患者基本信息、疾病发作特点、既往用药及现用药物诊疗方案、检查检验、疾病的自我认知和既往接受医务人员干预情况。

    2.2.2   评估患者吸入装置操作正确性

    吸入疗法是咳喘患者治疗的基石[13],对控制患者病情起到了至关重要的作用。在诊室内辅以各种吸入装置宣教视频,反复多次指导患者操作吸入装置,当场纠正操作错误,要求患者学会后能自主操作。对其装置操作进行评分,根据制作的技术评估表进行打分,满分18分,操作正确1项得1分,不正确得0分。0~8分为差,9~12分为中等,13~17分为好,18分为良好。

    2.2.3   评估患者用药依从性

    对患者吸入装置、祛痰药、激素类等药物使用依从性的评价采用MMAS-8量表[14]。量表满分为8分。得分<6分表示依从性差,得分6~7分表示依从性中等,得分8分表示依从性好。

    2.2.4   评估患者疾病临床有效控制情况

    哮喘采用支气管哮喘控制测试(ACT)评分[15],ACT总分为25分,<20分为无效,20~24分为有效,25分为显效。COPD 采用COPD评估测试(CAT)评分[16],CAT评分总分为40分,0~10分为轻微影响,11~20分为中等影响,21~30分为严重影响,31~40分为非常严重影响。

    2.2.5   安全性评价

    通过电话随访记录患者治疗过程中所有药物相关的不良反应,计算不良反应发生率,用于评估用药安全性。不良反应发生率= 不良反应发生例数/总例数×100%。

    2.2.6   满意度评分

    设计满意度评分问卷,对患者进行满意度评分。满意度评分问卷由8个条目组成,第1~7条目,回答“是”得1分,回答“否”得0分,第8个条目为患者对药学服务模式的建议[17]

    2.2.7   用药干预与指导及科普宣教

    针对不同咳喘患者治疗方案进行个体化用药指导,包括联合用药(如祛痰药、激素类药等)的使用、用药注意事项、用药教育等,制作个体化用药清单。每两周开展用药知识讲座,包括疾病科普知识、致病因素和常用治疗方法、吸入制剂和其他治疗药物的正确使用、常见用药错误和不良反应、生活方式及运动宣教指导等,并发放宣传资料,提升患者病情自我控制技巧和护理能力。

    采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。计量资料先进行正态分析,服从正态分布数据以均数±标准差($ \bar{x}\pm s $) 表示,两样本比较采用t检验,非正态分布数据以中位数M( P25,P75)表示,各组总体水平差异采用秩和检验(Kruskal-Wallis H检验),有统计学意义采用Bonferroni法进行两两比较。以P<0.05表示差异有统计学意义。

    经3次用药指导,采用Kruskal-Wallis H检验分别比较68例患者干预前与干预1、2、3次后吸入装置操作评分。结果显示,干预前与干预后各组装置操作评分存在统计学差异(H=214.240,P<0.05)。经多重两两成对比较结果显示,干预次数各组间的装置评分均有显著性差异(P<0.05),见图1

    图  1  干预前后患者吸入装置评分对比情况图
    *P<0.05,干预前后比较或不同干预次数的比较。

    经3个月规范化治疗,采用Kruskal-Wallis H检验分别比较68例患者干预前、干预1、2、3月后的用药依从性评分。结果显示,干预前与干预后各组MMAS-8评分均存在统计学差异(H=94.005,P<0.05)。经多重两两成对比较结果显示,干预1个月后与干预2个月后的MMAS-8评分无显著性差异(P>0.05),其它各组间的MMAS-8评分均有显著性差异(P<0.05),见图2

    图  2  干预前后患者用药依从性评分对比情况图
    *P<0.05,干预前后比较或不同干预时间的比较。

    68例有效随访患者中哮喘患者共30人,COPD患者共38人,采用配对样本t检验统计干预前和干预3个月后患者临床效果评估指标评分。结果显示,干预后ACT评分显著升高,干预前后评分比较均有显著性差异(t=25.54,P<0.05);CAT评分显著下降,干预前后评分有显著性差异(t=−26.71,P<0.05),见图3

    图  3  干预前后患者ACT/CAT评分对比情况图
    *P<0.05,干预前后比较。

    68例咳喘患者干预前后均未发生严重不良反应,干预前发生的不良反应主要有口干(5.88%)、声音嘶哑(4.41%)、咽喉不适(2.94%)、口腔溃疡(2.94%)、白假丝酵母菌感染(1.47%)等,总不良反应发生率17.65%;经3个月的用药干预,总不良反应发生率降为4.41%,主要有口干2例(2.94%)、声音嘶哑 1 例(1.47%)。

    通过电话随访对患者进行满意度评分,结果显示:除第1、5、8条外,患者的满意度均在97%以上(表1)。

    表  1  患者满意度调查表
    项目占比
    1.从未在门诊接受过这种药学服务60/68(88.24%)
    2.对药师提供的药学服务感到满意67/68(98.53%)
    3.与药师交流非常舒服67/68(98.53%)
    4.对药师解答的有关问题感到满意66/68(97.06%)
    5.接受药学服务后,对哮喘、COPD 和
    药物治疗的认识有所提高
    58/68(85.29%)
    6.向使用吸入器的朋友和家人推荐这项药学服务66/68(97.06%)
    7.希望接受其他疾病的这种药学服务67/68(98.53%)
    8.对该药学服务有一些建议23/68(33.82%)
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    随着药师工作职能的转型,药师在慢病管理方面的作用正在逐渐显现[18]。我院药师借鉴药物治疗管理模式,在实践中以咳喘慢病管理为切入点,开展咳喘医药联合门诊,将药物治疗与疾病管理有机结合,以期达成医师-药师-患者疾病管理共识。医药联合门诊一方面为患者提供了更全面、优质、规范化服务,使患者远期获益;一方面让医师更专注于疾病诊治,更好地发挥临床优势;另一方面药师以此为契机,提升专业能力,实现药师专业价值。

    长期规范的吸入用药是咳喘患者治疗的核心,药师在工作中发现,患者吸入装置使用不当,用药依从性低(如吸入技术不规范、自行增/减给药剂量、停药等)[18],会造成疗效降低,甚至导致患者肺功能下降,疾病急性加重次数/再次入院风险增加,死亡风险增加[19]。在联合门诊内,药师结合患者病情及用药情况,开展个体化药学监护、干预和指导、疾病和用药知识宣教等,以提高患者用药依从性,开展不良反应监测和定期随访,以实现对患者疗效、安全性及疾病控制情况的持续管理,为疗效评估、治疗方案的调整提供依据。从干预结果看,经药师反复指导干预后,大部分患者吸入装置使用和其他合并治疗药物(如祛痰药、激素类等)能正确使用。随着干预时间的延长,3个月后用药依从性有所增加,但总体依从性为中等水平,仅部分患者达到良好。在比较干预1个月后与2个月后依从性时发现其MMAS-8得分虽有增加,但无统计学差异。可能与部分患者存在经济、生活方式改变、偶有漏服、症状缓解自主减量或停药、对疾病认识不足、未按时复诊、对药师信任度不够等因素有关。针对患者存在的不同问题,随访后期药师加强了与患者线上沟通,提醒患者按时服药,对无法按时复诊患者提供线上用药咨询与宣教指导,提高干预时效性,以提高用药依从性。满意度调查显示,患者对疾病和药物治疗的认识有所提高。随着患者依从性和用药知识的提高,干预3个月后咳喘患者临床症状控制情况有所改善。干预后不良反应发生率有所降低,用药安全性也有所提高。从调查结果看,通过医药联合门诊对咳喘患者进行长期、规范化管理,可使患者获得较好的临床疗效。

    医药联合门诊在一定程度上可以提高临床疗效、用药依从性和用药安全,但因各种原因所致患者的流失在实践中普遍存在。国外文献报道,经健康管理患者流失率达73%[20]。患者的流失,严重影响患者规范化治疗。后期通过加强实时监护和陪伴宣教与患者建立信任关系[21],通过医联体、科普公众号等多种形式加强与患者沟通交流,以减少患者流失。此外,实践中还存在医师、药师观点不一致,沟通不畅等问题,加强与医师沟通交流,提升自身各项药学服务技能,达成团队共识也至关重要。

    受开设时间、工作经验不足、信息技术等因素限制,本研究仅对部分临床疗效进行了初步评价,患者肺功能变化、年急性发病/住院次数、就诊花费等内容尚未评价分析。患者长期用药依从性、症状有效控制情况、药物安全性仍需加强宣教及随访监护,药学服务内容和患者满意度调查内容有待优化。后期将继续积累实践经验,优化工作模式,进一步探索评价各项指标,最终实现患者慢病自我管理。医药联合门诊在慢病长期规范化管理方面具有一定可行性,药师仍需在长期实践中优化管理和积累经验,为发展“以病人为中心”的优质化慢病药学服务提供参考。

  • 图  1  20批大黄叠加指纹图谱

    T1-T5.唐古特大黄样品;Y1-Y7.药用大黄样品;Z1-Z8.掌叶大黄样品

    图  2  混合对照品及3种基原大黄对照图谱

    A.混合对照品;B.唐古特大黄;C.药用大黄;D.掌叶大黄;1.芦荟大黄素;2.大黄素;3.大黄酚;4.大黄素甲醚

    图  3  大黄样品聚类分析树状图

    表  1  20批大黄采集信息表

    编号来源产地采集时间
    1唐古特大黄青海海东2021年9月
    2唐古特大黄青海海东2021年9月
    3唐古特大黄青海玉树2021年9月
    4唐古特大黄青海玉树2021年9月
    5唐古特大黄青海玉树2021年9月
    6药用大黄四川绵阳2021年9月
    7药用大黄四川绵阳2021年9月
    8药用大黄四川阿坝州2021年9月
    9药用大黄湖北恩施州2021年9月
    10药用大黄四川阿坝州2021年9月
    11药用大黄湖北恩施州2021年9月
    12药用大黄四川阿坝州2021年9月
    13掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
    14掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
    15掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
    16掌叶大黄甘肃宕县2021年9月
    17掌叶大黄甘肃宕县2021年9月
    18掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
    19掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
    20掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
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    表  2  梯度洗脱条件

    时间(t/min)流动相(A)流动相(B)
    0.01090
    5.02575
    45.06040
    60.07030
    70.08020
    90.08020
    90.11090
    100.11090
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    表  3  掌叶大黄相似度结果

    序号S1S2S3S4S5S6S7S8对照
    S11.0000.9690.9930.9890.9800.9760.9950.9860.991
    S20.9691.0000.9890.9930.9930.9890.9860.9930.993
    S30.9930.9891.0000.9970.9930.9900.9980.9980.999
    S40.9890.9930.9971.0000.9970.9860.9960.9960.998
    S50.9800.9930.9930.9971.0000.9820.9890.9940.995
    S60.9760.9890.9900.9860.9821.0000.9890.9930.992
    S70.9950.9860.9980.9960.9890.9891.0000.9960.998
    S80.9860.9930.9980.9960.9940.9930.9961.0000.999
    对照0.9910.9930.9990.9980.9950.9920.9980.9991.000
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    表  4  唐古特大黄相似度结果

    序号 S1 S2 S3 S4 S5 对照
    S1 1.000 0.992 0.987 0.996 0.990 0.996
    S2 0.992 1.000 0.992 0.994 0.994 0.997
    S3 0.987 0.992 1.000 0.987 0.998 0.996
    S4 0.996 0.994 0.987 1.000 0.994 0.997
    S5 0.990 0.994 0.998 0.994 1.000 0.998
    对照 0.996 0.997 0.996 0.997 0.998 1.000
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    表  5  药用大黄相似度结果

    序号S1S2S3S4S5S6S7对照
    S11.0000.9840.9640.9960.9780.9920.9780.996
    S20.9841.0000.9120.9800.9510.9940.9770.986
    S30.9640.9121.0000.9750.9770.9380.9410.964
    S40.9960.9800.9751.0000.9870.9900.9830.998
    S50.9780.9510.9770.9871.0000.9760.9840.987
    S60.9920.9940.9380.9900.9761.0000.9900.996
    S70.9780.9770.9410.9830.9840.9901.0000.991
    对照0.9960.9860.9640.9980.9870.9960.9911.000
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    表  6  流动相梯度洗脱程序

    时间(t/min)流动相A(%)流动相B(%)
    0~17030
    1~1270→030→100
    12~140100
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    表  7  线性参数表

    农药测定方法线性范围(µg/L)线性回归方程相关系数
    甲胺磷LC-MS/MS5.10~102Y=5 757.95X-9 518.720.999 7
    涕灭威亚砜LC-MS/MS9.95~199Y=4 925.37X+2 962.420.999 2
    久效磷LC-MS/MS3.00~60Y=14 184.41X-13 024.630.999 6
    涕灭威砜LC-MS/MS10.20~202Y=7 266.57X-25 291.330.999 8
    3-羟基克百威LC-MS/MS5.20~104Y=3 651.39X-9 142.130.998 5
    硫环磷LC-MS/MS3.10~62Y=7 354.36X-5 852.390.999 7
    苯线磷亚砜LC-MS/MS2.05~41Y=655.91X-32.390.999 8
    磷胺LC-MS/MS5.15~103Y=3 005.51X-5 182.820.999 0
    涕灭威LC-MS/MS10.10~202Y=11 866.99X-36 969.070.999 6
    甲磺隆LC-MS/MS4.85~97Y=2 297.70X-1 847.560.999 1
    苯线磷砜LC-MS/MS2.00~40Y=1 208.50X-552.450.997 8
    克百威LC-MS/MS5.05~101Y=11 404.76X-20 949.400.998 8
    氯磺隆LC-MS/MS5.05~101Y=894.56X-339.120.999 7
    甲拌磷亚砜LC-MS/MS2.05~41Y=10 206.115X-5 030.100.999 8
    胺苯磺隆LC-MS/MS5.00~100Y=4 500.82X-6 147.150.998 6
    内吸磷LC-MS/MS2.10~42Y=6 926.58X-4 823.800.999 3
    特丁硫磷LC-MS/MS2.00~40Y=16 908.79X-7 218.660.999 8
    甲拌磷砜LC-MS/MS1.95~39Y=451.97X-397.400.995 4
    水胺硫磷LC-MS/MS5.05~101Y=13 593.18X-18 646.430.999 7
    苯线磷LC-MS/MS2.00~40Y=3 783.93X-1 458.190.999 3
    灭线磷LC-MS/MS2.05~41Y=6 444.63X-3 624.020.999 5
    特丁硫磷砜LC-MS/MS2.10~42Y=947.36X+163.480.998 7
    氯唑磷LC-MS/MS1.00~20Y=11 742.40X-2 819.510.999 6
    硫线磷LC-MS/MS2.00~40Y=9 943.19X-7 358.470.999 3
    甲基异柳磷LC-MS/MS2.10~42Y=20 034.52X-18 536.680.999 2
    地虫硫磷LC-MS/MS2.05~41Y=581.22X-921.560.999 5
    蝇毒磷LC-MS/MS5.05~101Y=527.96X-760.590.999 8
    治螟磷LC-MS/MS2.05~41Y=9 943.19X-7 358.470.999 3
    甲拌磷LC-MS/MS2.05~41Y=353.64X-30.700.999 2
    杀虫脒LC-MS/MS2.10~42Y=1.947 933X+0.014 0930.995 3
    α-六六六GC-MS/MS4.95~99Y=4.880 537X-0.007 8510.998 8
    特丁硫磷GC-MS/MS2.10~42Y=9.683 112X-0.016 6380.996 1
    β-六六六GC-MS/MS4.90~98Y=4.061 750X-0.031 0090.997 1
    氟甲腈GC-MS/MS2.15~43Y=2.987 868X+0.007 8710.998 7
    γ-六六六GC-MS/MS4.70~94Y=3.840 197X+0.053 6110.997 2
    δ-六六六GC-MS/MS4.75~95Y=5.344 570X-0.013 9350.998 1
    艾氏剂GC-MS/MS4.75~95Y=1.527 440X+0.001 4310.998 8
    甲基对硫磷GC-MS/MS1.90~38Y=3.734 819X+0.029 2430.999 5
    氟虫腈硫化物GC-MS/MS2.00~40Y=5.988 870X+0.002 5750.997 3
    氟虫腈GC-MS/MS2.10~42Y=3.631 274X-0.019 0630.998 4
    对硫磷GC-MS/MS2.00~40Y=1.428 485X-0.010 1800.999 6
    三氯杀螨醇GC-MS/MS5.00~100Y=9.069 256X-0.030 6260.998 2
    α-硫丹GC-MS/MS5.20~104Y=0.695 002X+0.006 0660.999 4
    氟虫腈砜GC-MS/MS1.95~39Y=2.529 407X-0.031 9480.994 6
    4,4'-滴滴伊GC-MS/MS4.70~94Y=11.689 424X-0.043 8650.999 0
    狄氏剂GC-MS/MS5.15~103Y=1.010 844X-0.010 7620.999 0
    除草醚GC-MS/MS5.10~102Y=1.658 219X-0.009 2270.997 3
    2,4'-滴滴涕GC-MS/MS4.90~98Y=12.444 953X-0.117 270.998 4
    4,4'-滴滴滴GC-MS/MS4.75~95Y=6.152 856X+0.000 80.999 6
    β-硫丹GC-MS/MS4.90~98Y=0.629 329X-0.002 0750.998 3
    4,4'-滴滴涕GC-MS/MS4.75~95Y=9.002 096X-0.058 0950.997 6
    硫丹硫酸酯GC-MS/MS4.85~97Y=0.579 655X-0.001 6580.999 7
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    表  8  大黄农药残留检测中33种农药回收率实验

    农药平均回收率(%)RSD(%)农药平均回收率(%)RSD(%)
    甲胺磷65.91.28蝇毒磷65.67.45
    涕灭威亚砜77.21.93治螟磷72.93.57
    久效磷76.32.02甲拌磷64.12.63
    涕灭威砜75.63.98杀虫脒100.83.65
    3-羟基克百威76.94.55α-六六六92.34.71
    硫环磷73.53.09特丁硫磷94.05.08
    苯线磷亚砜85.15.72β-六六六95.24.83
    磷胺80.23.83氟甲腈100.94.63
    涕灭威73.23.03γ-六六六100.23.84
    甲磺隆94.410.26δ-六六六92.62.21
    苯线磷砜80.75.93艾氏剂94.44.55
    克百威78.13.90甲基对硫磷99.94.53
    氯磺隆96.59.18氟虫腈硫化物96.64.88
    甲拌磷亚砜75.74.21氟虫腈94.54.09
    胺苯磺隆74.26.22对硫磷92.15.10
    内吸磷64.14.68三氯杀螨醇87.72.80
    特丁硫磷74.93.43α-硫丹95.65.37
    甲拌磷砜84.12.74氟虫腈砜94.73.63
    水胺硫磷78.54.234,4'-滴滴伊101.24.07
    苯线磷69.65.98狄氏剂99.93.66
    灭线磷68.54.04除草醚94.22.33
    特丁硫磷砜80.54.762,4'-滴滴涕101.34.73
    氯唑磷73.24.824,4'-滴滴滴96.91.12
    硫线磷62.13.13β-硫丹94.26.55
    甲基异柳磷72.14.604,4'-滴滴涕100.93.73
    地虫硫磷65.46.17硫丹硫酸酯97.02.57
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-10-30
  • 修回日期:  2024-05-06
  • 网络出版日期:  2024-07-16
  • 刊出日期:  2024-07-25

大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
    基金项目:  杭州市卫生科技计划项目(B20210302)
    作者简介:

    毛泽玲,主管中药师,研究方向:中药活性成分及质量标准研究,Tel:15757165880,Email:876231359@qq.com

    通讯作者: 文 波,高级工程师,研究方向:中药质量标准研究,Tel:18067998908,Email:wenborin@126.com

摘要:   目的  建立不同种大黄的HPLC特征指纹图谱和禁用农药残留检测方法,并综合评价其药材质量。  方法  收集3种大黄共20批,采用HPLC法进行分析,流动相为甲醇-0.1 %磷酸溶液;梯度洗脱;柱温35 ℃;检测波长254 nm;流速1.0 ml/min;并对结果进行聚类分析。采用直接提取法,并建立HPLC-串联质谱法,气相色谱-串联质谱法,对不同来源、产地大黄的33种禁用农药进行检测。  结果  掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度均>0.95,聚类分析将20批大黄样品分为3类。不同产地的大黄样品均未检出33种禁用农药。  结论  3种大黄药材质量差异较大,建立的HPLC指纹图谱和禁用农残的方法稳定、可靠、简便准确,可以为大黄的质量控制评价提供依据。

English Abstract

王璐暖, 吴建辉, 何贝轩, 张彦洁, 郭美丽. 羟基红花黄色素A生物合成途径短链还原酶基因的特征及功能研究[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(3): 218-225. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202201061
引用本文: 毛泽玲, 文波. 大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(7): 297-304, 314. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
WANG Lunuan, WU Jianhui, HE Beixuan, ZHANG Yanjie, GUO Meili. Characterization and function of short-chain dehydrogenases/reductases in hydroxysafflower yellow A biosynthesis pathway[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(3): 218-225. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202201061
Citation: MAO Zeling, WEN Bo. HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(7): 297-304, 314. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
  • 大黄为蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Bail1.)的干燥根和根茎,用于实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、痈肿疔疮、肠痈腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、跌打损伤、湿热痢疾、黄疸尿赤、淋证、水肿以及外治烧烫伤[1]。研究表明,大黄含有蒽醌类、二苯乙烯类、苯丁酮类、多糖类、有机酸类、鞣质和多酚类等化学成分,具有泻下、抗衰老、抗肿瘤、防治心血管系统疾病和降血糖等多种药理作用[2-6]

    大黄主要分布于我国甘肃陇南、临洮、宕县、礼县、武都、华庭、青海海东、玉树、海北、四川阿坝、湖北恩施和重庆奉节等地[7-8]。近年来,大黄市场需求量逐渐增加,野生药材逐渐枯竭,家种大黄已经成为市场主流商品。但由于种植环境、种植技术水平差异较大,导致药材质量参差不齐,建立一套整体、全面的大黄药材质量控制方法尤为重要[9-12]

    本研究收集3种来源的20批大黄样品,建立大黄的HPLC指纹图谱并进行方法学考察。建立了检测大黄中33种禁用农药残留的方法并进行方法学考察,为更充分利用大黄药材资源提供实验基础。

    • SHIMADZU 20AT HPLC仪(日本岛津公司);XS105万分之一分析天平[Mettler-Toledo international trading(Shanghai)co., Ltd.];电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。Agilent 1260-6470 QQQ三重四极杆质谱仪,Agilent 8890-7000D气相色谱仪-三重串联四极杆质谱仪;LC-SFJ-10型手持高速匀浆机;GIPP型水浴氮吹仪;RG-160AT型离心机;Direct-Q3UV型超纯水机;XS105型电子天平;RE-52A型旋转蒸发仪;Vortex-250OMT型多管旋涡混合仪;WSZ-200A型振荡器。

    • 芦荟大黄素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110795-202011,纯度:97.5%),大黄素甲醚对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110758-201817,纯度:99.2%),大黄酚对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110796-201922,纯度:99.4%),大黄素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110756-201913,纯度:96.0%),禁用农药混合对照溶液(中国食品药品检定研究院,批号:610020-202202),甲醇为分析纯(杭州高晶精细化工有限公司);磷酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司);色谱纯乙腈 、甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司);其余试剂均为分析纯。

    • 20批大黄药材分别采集于甘肃、青海、四川、湖北,大黄药材经嘉兴东方国药饮片股份有限公司朱涛副主任药师鉴定为蓼科大黄属植物掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根和根茎,见表1

      表 1  20批大黄采集信息表

      编号来源产地采集时间
      1唐古特大黄青海海东2021年9月
      2唐古特大黄青海海东2021年9月
      3唐古特大黄青海玉树2021年9月
      4唐古特大黄青海玉树2021年9月
      5唐古特大黄青海玉树2021年9月
      6药用大黄四川绵阳2021年9月
      7药用大黄四川绵阳2021年9月
      8药用大黄四川阿坝州2021年9月
      9药用大黄湖北恩施州2021年9月
      10药用大黄四川阿坝州2021年9月
      11药用大黄湖北恩施州2021年9月
      12药用大黄四川阿坝州2021年9月
      13掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
      14掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
      15掌叶大黄甘肃陇南2021年9月
      16掌叶大黄甘肃宕县2021年9月
      17掌叶大黄甘肃宕县2021年9月
      18掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
      19掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
      20掌叶大黄甘肃礼县2021年9月
    • 精密称取大黄粉末0.5 g(过四号筛),置具塞锥形瓶中,精密加入25 ml分析纯甲醇,称定重量,水浴加热回流1 h,放冷,用分析纯甲醇补足减失的重量,过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

    • 精密称取芦荟大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酚对照品、大黄素对照品适量,加色谱纯甲醇制成每1 ml含芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄素各16 μg的混合溶液,摇匀,备用。

    • 色谱柱:Silversil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);以色谱纯甲醇为流动相A,以0.1 %磷酸溶液为流动相B,按照表2进行梯度洗脱;流速为1.0 ml/min;检测波长为254 nm;柱温为35 ℃;进样量为10 μl。

      表 2  梯度洗脱条件

      时间(t/min)流动相(A)流动相(B)
      0.01090
      5.02575
      45.06040
      60.07030
      70.08020
      90.08020
      90.11090
      100.11090
    • (1)空白试验

      吸取分析纯甲醇,在“2.1.3”色谱条件下测定,未见干扰。

      (2)精密度考察

      按“2.1.1”项下方法制备编号为1的掌叶大黄供试品溶液,按“2.1.3”色谱条件,连续进样6 次 ,记录液相色谱图,计算精密度。以9号峰(芦荟大黄素)为参照峰,各共有峰保留时间的RSD值为0.02 %~0.04 %,峰面积的RSD值范围为0.04 %~0.73 %,均小于2 %。表明仪器精密度良好。

      (3)稳定性考察

      取编号为1的掌叶大黄,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液,放置0、2、4、6、8、10、12 h并按“2.1.3”色谱条件进样,以9号峰(芦荟大黄素)为参照峰,各共有峰保留时间的RSD值为0.02 %~0.04 %,峰面积的RSD值范围为0.32 %~1.70 %,均小于2 %,表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

      (4)重复性考察

      取编号为1的掌叶大黄,按“2.1.1”项下方法制备 6 份供试品溶液,按“2.1.3”色谱条件进样测定,以9号峰(芦荟大黄素)为参照峰,各共有峰相对保留时间的RSD值范围为0.03 %~0.07 %,峰面积的RSD值范围为0.45 %~1.54 %, RSD值均小于2 %,表明该方法重复性良好。

    • 取不同来源的大黄样品20批(表1),按“2.1”项下方法制备大黄供试品溶液并进样测定,得到20批大黄样品色谱图,图谱显示掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的液相色谱图差异较大,每个来源大黄的色谱图之间差异较小,将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”,共标定12个共有特征峰,分别以每个来源样品的色谱图为参照图谱,采用中位数法,时间窗宽度为0.1,得到3种来源大黄的HPLC对照图谱,见图1图2。相似度评价结果见表3表5。大黄样品与其对照指纹图谱的相似度均>0.95,说明同一来源大黄样品的质量比较接近。

      图  1  20批大黄叠加指纹图谱

      图  2  混合对照品及3种基原大黄对照图谱

      表 3  掌叶大黄相似度结果

      序号S1S2S3S4S5S6S7S8对照
      S11.0000.9690.9930.9890.9800.9760.9950.9860.991
      S20.9691.0000.9890.9930.9930.9890.9860.9930.993
      S30.9930.9891.0000.9970.9930.9900.9980.9980.999
      S40.9890.9930.9971.0000.9970.9860.9960.9960.998
      S50.9800.9930.9930.9971.0000.9820.9890.9940.995
      S60.9760.9890.9900.9860.9821.0000.9890.9930.992
      S70.9950.9860.9980.9960.9890.9891.0000.9960.998
      S80.9860.9930.9980.9960.9940.9930.9961.0000.999
      对照0.9910.9930.9990.9980.9950.9920.9980.9991.000

      表 4  唐古特大黄相似度结果

      序号 S1 S2 S3 S4 S5 对照
      S1 1.000 0.992 0.987 0.996 0.990 0.996
      S2 0.992 1.000 0.992 0.994 0.994 0.997
      S3 0.987 0.992 1.000 0.987 0.998 0.996
      S4 0.996 0.994 0.987 1.000 0.994 0.997
      S5 0.990 0.994 0.998 0.994 1.000 0.998
      对照 0.996 0.997 0.996 0.997 0.998 1.000

      表 5  药用大黄相似度结果

      序号S1S2S3S4S5S6S7对照
      S11.0000.9840.9640.9960.9780.9920.9780.996
      S20.9841.0000.9120.9800.9510.9940.9770.986
      S30.9640.9121.0000.9750.9770.9380.9410.964
      S40.9960.9800.9751.0000.9870.9900.9830.998
      S50.9780.9510.9770.9871.0000.9760.9840.987
      S60.9920.9940.9380.9900.9761.0000.9900.996
      S70.9780.9770.9410.9830.9840.9901.0000.991
      对照0.9960.9860.9640.9980.9870.9960.9911.000
    • 根据保留时间比对确定共有指纹峰,对20批大黄HPLC指纹图谱测定结果进行比较分析,确定12个共有指纹峰。通过与对照品的保留时间比对,确定大黄图谱9号峰为芦荟大黄素, 10号峰为大黄素,11号峰为大黄酚,12号峰为大黄素甲醚。

    • 采用组间联接法,以峰面积为变量,用SPSS 26.0软件对20批大黄进行聚类分析。由聚类分析树状图可知, 20批不同样品可聚为3类,5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类,药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类,药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类。聚类分析树状图见图3

      图  3  大黄样品聚类分析树状图

    • 参照《中国药典2020年版》四部2341农药残留量测定法测定。

    • (1)气相色谱质谱条件

      色谱条件:用(50%苯基)-甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱(柱长30 m,膜厚度0.25 µm,柱内径0.25 mm)。进样口温度为250 ℃,不分流进样。载气为高纯氦气。进样口为恒压模式,柱前压力为146 kPa。程序升温:设定初始温度为60 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至120 ℃,再以10 ℃/min升至160 ℃,再以2 ℃/min的速率升温至230 ℃,最后以15 ℃/min升温至300 ℃,保持6 min。

      质谱条件:以三重四极杆串联质谱仪检测;离子源为电子轰击源,离子源温度250 ℃。碰撞气为氮气。质谱传输接口温度280 ℃。质谱监测模式为多反应监测。

      (2)液相色谱质谱条件

      色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长10 cm,粒径2.6 µm,内径2.1 mm);以0.1 %甲酸溶液(含5 mmol/L甲酸铵)为流动相A,以乙腈-0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L甲酸铵)(95∶5)为流动相B,按下表6进行梯度洗脱;流速为0.3 ml/min,柱温为40 ℃。

      表 6  流动相梯度洗脱程序

      时间(t/min)流动相A(%)流动相B(%)
      0~17030
      1~1270→030→100
      12~140100

      质谱条件:以三重四极杆串联质谱仪检测;离子源为电喷雾离子源,正离子扫描模式。监测模式为多反应监测。

    • (1) 提取

      取过三号筛的大黄粉末5 g,精密称定,加1 g氯化钠,立即摇散,再加入50 ml乙腈,匀浆处理2 min(转速不低于12 000 r/min),再至4 000 r/min的离心机中离心,取上清液,剩余沉淀再加50 ml乙腈,匀浆处理1 min,再离心,合并两次提取的上清液,减压浓缩至约5 ml,用乙腈稀释至10 ml,摇匀,即得。

      (2)净化

      ①气相色谱-串联质谱法:量取乙腈:甲苯(3∶1)10 ml过SelectCore GCB/NH2-A固相萃取柱 (500 mg/500 mg/6 ml)(纳谱分析)活化,溶液弃去,精密量取“提取”中制备的供试品溶液2 ml置萃取柱上,待萃取小柱中样品液全部通过,用20 ml乙腈:甲苯(3∶1)洗脱,收集全部洗脱液,40 ℃以下减压回收至近干,用乙腈稀释至2.0 ml,混匀,即得。②高效液相色谱-串联质谱法:量取上述供试品溶液3 ml,通过亲水亲油平衡材料SelectCore HLB-B固相萃取柱(200 mg,6 ml)(纳谱分析)净化,收集全部净化液,即得。

    • (1)混合对照品溶液的制备

      取已知浓度的禁用农药混合对照品溶液(已标示各相关农药品种的浓度),精密量取1 ml,置20 ml容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀,即得。

      (2)气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

      精密称取磷酸三苯酯对照品适量,精密称定,加乙腈溶解并制溶解并制成每1 ml含l.0 mg的溶液。精密量取适量,加乙腈制成每1 ml含0.1 µg的溶液。

      (3)空白基质溶液的制备

      取不含农残的空白大黄基质样品,同供试品溶液的制备方法处理,得到空白基质溶液。

      (4)基质混合对照溶液的制备

      精密量取上述空白基质溶液1.0 ml(6份),置40 ℃水浴氮吹仪上,氮吹浓缩至约0.6 ml,分别加入混合对照品溶液10、20、50、100、150、200 µl,加乙腈稀释至1 ml,混匀,即得。

    • (1)气相色谱-串联质谱法

      分别精密吸取上述的供试品溶液和基质混合对照溶液各1 ml,分别精密加入内标溶液0.3 ml,混匀过滤,取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1 µl,注入仪器,按内标曲线法计算,即得。

      (2)高效液相色谱-串联质谱法

      分别精密吸取上述的基质混合对照溶液和供试品溶液各1 ml,精密加入水0.3 ml,混匀过滤,取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1 µl,注入仪器,按外标曲线法计算,即得。

    • (1)标准曲线

      将33种禁用农药的基质混合溶液,按照“2.3.4”项下方法进行测定,以不同农药的质量浓度为横坐标,对应的响应值为纵坐标,绘制工作曲线。结果表明:33种禁用农药的质量浓度在线性范围内与其对应的响应值呈线性关系,线性参数表见表7

      表 7  线性参数表

      农药测定方法线性范围(µg/L)线性回归方程相关系数
      甲胺磷LC-MS/MS5.10~102Y=5 757.95X-9 518.720.999 7
      涕灭威亚砜LC-MS/MS9.95~199Y=4 925.37X+2 962.420.999 2
      久效磷LC-MS/MS3.00~60Y=14 184.41X-13 024.630.999 6
      涕灭威砜LC-MS/MS10.20~202Y=7 266.57X-25 291.330.999 8
      3-羟基克百威LC-MS/MS5.20~104Y=3 651.39X-9 142.130.998 5
      硫环磷LC-MS/MS3.10~62Y=7 354.36X-5 852.390.999 7
      苯线磷亚砜LC-MS/MS2.05~41Y=655.91X-32.390.999 8
      磷胺LC-MS/MS5.15~103Y=3 005.51X-5 182.820.999 0
      涕灭威LC-MS/MS10.10~202Y=11 866.99X-36 969.070.999 6
      甲磺隆LC-MS/MS4.85~97Y=2 297.70X-1 847.560.999 1
      苯线磷砜LC-MS/MS2.00~40Y=1 208.50X-552.450.997 8
      克百威LC-MS/MS5.05~101Y=11 404.76X-20 949.400.998 8
      氯磺隆LC-MS/MS5.05~101Y=894.56X-339.120.999 7
      甲拌磷亚砜LC-MS/MS2.05~41Y=10 206.115X-5 030.100.999 8
      胺苯磺隆LC-MS/MS5.00~100Y=4 500.82X-6 147.150.998 6
      内吸磷LC-MS/MS2.10~42Y=6 926.58X-4 823.800.999 3
      特丁硫磷LC-MS/MS2.00~40Y=16 908.79X-7 218.660.999 8
      甲拌磷砜LC-MS/MS1.95~39Y=451.97X-397.400.995 4
      水胺硫磷LC-MS/MS5.05~101Y=13 593.18X-18 646.430.999 7
      苯线磷LC-MS/MS2.00~40Y=3 783.93X-1 458.190.999 3
      灭线磷LC-MS/MS2.05~41Y=6 444.63X-3 624.020.999 5
      特丁硫磷砜LC-MS/MS2.10~42Y=947.36X+163.480.998 7
      氯唑磷LC-MS/MS1.00~20Y=11 742.40X-2 819.510.999 6
      硫线磷LC-MS/MS2.00~40Y=9 943.19X-7 358.470.999 3
      甲基异柳磷LC-MS/MS2.10~42Y=20 034.52X-18 536.680.999 2
      地虫硫磷LC-MS/MS2.05~41Y=581.22X-921.560.999 5
      蝇毒磷LC-MS/MS5.05~101Y=527.96X-760.590.999 8
      治螟磷LC-MS/MS2.05~41Y=9 943.19X-7 358.470.999 3
      甲拌磷LC-MS/MS2.05~41Y=353.64X-30.700.999 2
      杀虫脒LC-MS/MS2.10~42Y=1.947 933X+0.014 0930.995 3
      α-六六六GC-MS/MS4.95~99Y=4.880 537X-0.007 8510.998 8
      特丁硫磷GC-MS/MS2.10~42Y=9.683 112X-0.016 6380.996 1
      β-六六六GC-MS/MS4.90~98Y=4.061 750X-0.031 0090.997 1
      氟甲腈GC-MS/MS2.15~43Y=2.987 868X+0.007 8710.998 7
      γ-六六六GC-MS/MS4.70~94Y=3.840 197X+0.053 6110.997 2
      δ-六六六GC-MS/MS4.75~95Y=5.344 570X-0.013 9350.998 1
      艾氏剂GC-MS/MS4.75~95Y=1.527 440X+0.001 4310.998 8
      甲基对硫磷GC-MS/MS1.90~38Y=3.734 819X+0.029 2430.999 5
      氟虫腈硫化物GC-MS/MS2.00~40Y=5.988 870X+0.002 5750.997 3
      氟虫腈GC-MS/MS2.10~42Y=3.631 274X-0.019 0630.998 4
      对硫磷GC-MS/MS2.00~40Y=1.428 485X-0.010 1800.999 6
      三氯杀螨醇GC-MS/MS5.00~100Y=9.069 256X-0.030 6260.998 2
      α-硫丹GC-MS/MS5.20~104Y=0.695 002X+0.006 0660.999 4
      氟虫腈砜GC-MS/MS1.95~39Y=2.529 407X-0.031 9480.994 6
      4,4'-滴滴伊GC-MS/MS4.70~94Y=11.689 424X-0.043 8650.999 0
      狄氏剂GC-MS/MS5.15~103Y=1.010 844X-0.010 7620.999 0
      除草醚GC-MS/MS5.10~102Y=1.658 219X-0.009 2270.997 3
      2,4'-滴滴涕GC-MS/MS4.90~98Y=12.444 953X-0.117 270.998 4
      4,4'-滴滴滴GC-MS/MS4.75~95Y=6.152 856X+0.000 80.999 6
      β-硫丹GC-MS/MS4.90~98Y=0.629 329X-0.002 0750.998 3
      4,4'-滴滴涕GC-MS/MS4.75~95Y=9.002 096X-0.058 0950.997 6
      硫丹硫酸酯GC-MS/MS4.85~97Y=0.579 655X-0.001 6580.999 7

      (2)回收率和重复性实验

      以空白大黄样品6份为基质,分别加入混合对照品溶液200 µl到样品中,做加标回收试验,根据实际曲线得到的响应值结果与理论值进行计算33种禁用农药的回收率和回收率的相对标准偏差(RSD)。结果表明:33种禁用农药的平均回收率为62.1%~101.3% ,回收率的 RSD为1.12%~10.26%。结果见表8

      表 8  大黄农药残留检测中33种农药回收率实验

      农药平均回收率(%)RSD(%)农药平均回收率(%)RSD(%)
      甲胺磷65.91.28蝇毒磷65.67.45
      涕灭威亚砜77.21.93治螟磷72.93.57
      久效磷76.32.02甲拌磷64.12.63
      涕灭威砜75.63.98杀虫脒100.83.65
      3-羟基克百威76.94.55α-六六六92.34.71
      硫环磷73.53.09特丁硫磷94.05.08
      苯线磷亚砜85.15.72β-六六六95.24.83
      磷胺80.23.83氟甲腈100.94.63
      涕灭威73.23.03γ-六六六100.23.84
      甲磺隆94.410.26δ-六六六92.62.21
      苯线磷砜80.75.93艾氏剂94.44.55
      克百威78.13.90甲基对硫磷99.94.53
      氯磺隆96.59.18氟虫腈硫化物96.64.88
      甲拌磷亚砜75.74.21氟虫腈94.54.09
      胺苯磺隆74.26.22对硫磷92.15.10
      内吸磷64.14.68三氯杀螨醇87.72.80
      特丁硫磷74.93.43α-硫丹95.65.37
      甲拌磷砜84.12.74氟虫腈砜94.73.63
      水胺硫磷78.54.234,4'-滴滴伊101.24.07
      苯线磷69.65.98狄氏剂99.93.66
      灭线磷68.54.04除草醚94.22.33
      特丁硫磷砜80.54.762,4'-滴滴涕101.34.73
      氯唑磷73.24.824,4'-滴滴滴96.91.12
      硫线磷62.13.13β-硫丹94.26.55
      甲基异柳磷72.14.604,4'-滴滴涕100.93.73
      地虫硫磷65.46.17硫丹硫酸酯97.02.57
    • 按照以上前处理方法对20批大黄样品进行测定,检测结果表明禁用农药均未检出。本研究显示该方法快速、高效和准确,可以作为日常药材监管和检验依据,对大黄中农药残留进行安全评估。

    • 本研究建立了20批不同产地不同种源大黄的指纹图谱,采用指纹图谱软件共标定出12个共有指纹峰。通过与对照品的色谱峰保留时间比对,4个色谱峰得到确认。生成3种不同来源大黄的指纹图谱,每一类大黄与其对照指纹图谱的相似度均大于0.95,说明建立的大黄指纹图谱方法具有较好的稳定性和可控性,能为质量评价提供参考依据。通过聚类分析将20批大黄分为3类,5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类,药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类,药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类,表明大黄药材的内在质量与大黄种属有一定的关联,可能还与产地,海拔,种植环境有关。综上所述,本研究所建立的不同来源大黄指纹图谱准确度高,灵敏度高,专属性强,可以为大黄的质量控制提供可靠依据。同时本研究建立了大黄中33种禁用农药检测方法,结果显示所有大黄样品均未检出禁用农药,风险较小。结果显示,该方法操作简单、重复性好,可用于大黄的禁用农药残留筛查。

参考文献 (12)

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