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川芎Rhizoma Chuanxiong为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎[1]，最早记载于《神农本草经》，有活血行气，祛风止痛的功效，是中医临床上最常用的药材之一，在活血化瘀类成方制剂中占有重要地位。
现代药理学表明，川芎含有多种药理活性成分，主要包括苯酞类化合物（如藁本内酯）、酚类和有机酸类（如阿魏酸）、生物碱类（如川芎嗪）、多糖类等，其中苯酞类化合物广泛的应用于治疗心脑血管系统和神经系统疾病，主要成分存在于川芎挥发油中，其含量占挥发油总质量的80%以上。川芎挥发油除含有苯酞类化合物，还含有烯萜醇、脂肪酸类化合物，近年来随制剂工艺的发展，川芎药材以挥发油入药已经比较常见，在制剂工艺方面，不同的提取工艺获得的川芎挥发油含量与成分不同，药效也会有差异[2-8]。川芎挥发油的常见提取方法主要有经典的水蒸气蒸馏法和近年来快速发展的超临界流体萃取技术(supercritical fluid extracation, SFE)，本研究分别采用水蒸气蒸馏法和超临界CO2萃取法两种常用工艺对川芎药材中挥发油类成分进行提取，并对提取成分进行比较，旨在为不同药效中药制剂中川芎有效成分的提取工艺研究提供参考。
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川芎药材（都江堰市伦洋中药材种植农民专业合作社，批号：Z02031-190201）；乙酸乙酯（色谱纯，美国TEDIA试剂有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；CO2为医用级；水为重蒸馏水。
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WF-20B高速万能粉碎机（江阴市海鑫药化机械制造有限公司）；HA420-40-96型超临界萃取装置（南通市华安超临界萃取有限公司）；挥发油测定器（天长市天沪分析仪器有限公司）；智能数显加热套（上海豫康科教仪器设备有限公司）；Thermo Fisher ITQ1100气相色谱-质谱联用仪（美国赛默飞世尔公司）。
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取川芎药材粉碎品（过一号筛）200 g，置5 000 ml圆底烧瓶中，加入2 000 ml蒸馏水、少许碎瓷片，充分混匀后于室温浸泡2 h，按《中国药典》2015版四部通则2204挥发油测定法甲法进行。提取完成后分取油层，无水硫酸钠干燥离心，转移挥发油置棕色瓶中密封，4 ℃保存。
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取川芎药材粉碎品（过一号筛）1 000 g，置萃取釜中，萃取条件为：萃取压力35 MPa，流体温度40 ℃，萃取1.5 h。萃取完成后从出料口放出挥发油，转移挥发油置棕色瓶中密封，4 ℃保存。
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InertCap 5MS/NP熔融石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；载气氦气；程序升温，初始温度60 ℃，保持1 min，5 ℃/min升温至100 ℃，3 ℃/min升温至160 ℃，保持2 min，10 ℃/min升温至280 ℃，保持2 min；进样口温度280 ℃；分流比30:1；传输线温度280 ℃；进样量1.0 μl，体积流量1.0 ml/min；离子源温度220 ℃；溶剂延迟4 min；EI源电离方式；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 50-400；质谱检索数据库NIST 11。
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精密移取挥发油提取物样品25 μl置于25 ml量瓶中，加入乙酸乙酯至刻度，摇匀，作为供试品溶液，吸取1.0 μl注入GC-MS联用仪进行分析。
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按照水蒸气蒸馏和超临界CO2萃取法提取挥发油后，根据得油量和药材量计算两种提取方法的挥发油得率分别为0.35%和4.8%。
采用GC-MS联用技术对两种提取工艺所得的挥发油提取物进行分析，利用质谱检索数据库和相关文献资料[9-12]，对挥发油中相对含量较大，与相邻峰分离度良好的主要色谱峰进行了分析，确定了18个主要成分，其峰面积总和占总峰面积的95%以上，结果见表1和图1、2。水蒸气蒸馏提取物中苯酞类成分约占61%，单萜类成分约占25%，倍半萜类成分约占10%；超临界CO2萃取物中苯酞类成分约占97%，单萜类成分约占1%，倍半萜类成分约占0.4%。两种提取工艺的挥发油中Z-藁本内酯含量最高，其次是洋川芎内酯A、丁烯基苯酞和丁基苯酞。
表 1 川芎挥发油化学成分
序号 TR/min 化合物 分子式 相对含量（%） 水蒸气蒸馏 超临界CO2萃取 1 5.66 α-蒎烯 C10H16 1.48 0.09 2 6.52 β-蒎烯 C10H16 5.70 0.30 3 7.71 邻伞花烃 C10H14 1.63 0.05 4 8.60 α-松油烯| C10H16 3.99 0.14 5 9.40 4-甲基-3-（1-甲基亚乙基）-1-环己烯 C10H16 3.66 0.21 6 11.43 1,3,5-十一碳三烯 C11H18 5.04 0.30 7 12.02 4-松油醇 C10H18O 3.56 0.05 8 20.91 4-异丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4α，7-四氢化萘 C15H24 1.31 0.22 9 23.21 γ-古芸烯 C15H24 6.11 0.85 10 23.56 β-马榄烯 C15H24 2.14 0.34 11 26.56 桉油烯醇 C15H24O 0.66 0.11 12 29.15 丁基苯酞 C12H14O2 1.31 0.89 13 29.93 丁烯基苯酞 C12H12O2 2.32 0.97 14 30.73 6-丁基-1,4-环庚二烯 C11H18 0.45 0.60 15 31.83 洋川芎内酯A C12H16O2 9.53 25.60 16 32.02 - - 1.97 2.95 17 32.33 Z-藁本内酯 C12H14O2 45.40 65.59 18 33.86 E-藁本内酯 C12H14O2 0.49 0.75 注：-表示未鉴定 
图 1 川芎水蒸气蒸馏挥发油总离子流图
图 2 川芎超临界CO2萃取挥发油总离子流图
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水蒸气蒸馏法是一种传统的挥发油提取工艺，对川芎药材中挥发性较强的成分如单萜和倍半萜类保留相对较强，适合低沸点、极性小的成分提取，且提取工艺对设备的要求不高，生产成本较低，在中药制剂工业上广泛应用，但是其挥发油提取率会相对较低。超临界CO2萃取法操作简单快速，基本2 h可完成提取过程，对川芎挥发油提取收率高，尤其对苯酞类有效成分的提取率相对较高，适合高沸点极性成分的提取，对环境及萃取产物无污染，便于提取工艺产业化。两种工艺的挥发油在成分上有一定的差异，因此在川芎挥发油入药的中药制剂工艺中，应根据制剂的功效充分考虑提取工艺对有效成分的影响，在适应证药效学研究的基础上分析不同工艺得到的挥发油的药效学和毒理学差异，而针对性的选择合适的提取工艺显得尤为重要。
Comparative study on volatile oil in Rhizoma chuanxiong by steam distillation and supercritical fluid extraction
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摘要:
目的 通过对不同工艺下得到的川芎挥发油的比较，阐明提取工艺对其有效成分的影响。 方法 分别采用超临界CO2萃取和水蒸气蒸馏法提取川芎挥发油，再通过气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术分析鉴定其中的主要化学成分及相对含量。 结果 2种方法所得川芎挥发油样品中共鉴定18种共有成分，水蒸气蒸馏提取物中苯酞类成分约占61%，单萜类成分约占25%，倍半萜类成分约占10%；超临界CO2萃取物中苯酞类成分约占97%，单萜类成分约占1%，倍半萜类成分约占0.4%。 结论 水蒸气蒸馏法对川芎药材中挥发性较强的单萜和倍半萜类保留相对较强，超临界CO2萃取法对苯酞类有效成分的提取率相对较高，因此在川芎挥发油入药的中药制剂工艺中，应根据制剂的功效充分考虑提取工艺对有效成分的影响。 Abstract:Objective To clarify the influence of the extraction process on its active ingredients by comparing the volatile oils of Rhizoma Chuanxiong obtained under different processes. Methods The volatile oil of Rhizoma Chuanxiong was extracted by supercritical CO2 extraction (SFE) and steam distillation. The main chemical components and relative contents were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Results A total of 18 common components were identified in the volatile oil samples of Chuanxiong from the two methods. In steam distillation samples, main components included phthalides (61%), monoterpenoids (25%) and sesquiterpenes (10%). In SFE samples, phthalides (97%) were major components, followed by monoterpenoids (1%),sesquiterpenes (0.4%) and other minor components. Conclusion The steam distillation retains highly volatile components in Rhizoma chuanxiong such as monoterpenoids and sesquiterpenes. For SFE approach, the phthalides were extracted more efficiently compared with other components. The effect of the extraction process on the active ingredients should be fully considered in obtained products of Rhizoma chuanxiong since the difference in constituents may result in varied effects. -
结直肠癌，又称大肠癌，好发于大肠黏膜，是常见消化系统恶性肿瘤，早期症状不明显不易发现，晚期则表现贫血、体重减轻等。由于现代生活节奏加快及各种不良饮食、作息、环境和遗传等因素的影响，使得我国的发病率逐年增加[1]。据《中国肿瘤登记年报》内容显示：2015年我国肿瘤登记地区结直肠癌发病率和病死率分别为17.1/10万和7.9/10万，发病率男女性别比和城乡比分别为1.5和1.4，病死率分别为1.6和1.4。与年报数据接近的《中国死因监测数据集》显示，2017年我国结直肠癌病死率为6.9/10万[2]。虽然，目前已有各种化疗、外科手术、中医治疗等诊治方法，但是仍然存在早期诊查率低、预后差等问题，患者术后5年的生存率仍没有得到较大的改善，故针对结直肠癌的诊疗研究亦成为现在的热点[3]。
卡培他滨（Cap）是结直肠癌辅助化疗及一线治疗药物，通常与多西他赛、奥沙利铂、爱必妥等联合应用，常见结直肠癌化疗方案是联合奥沙利铂。Cap是前体药，体内转化成氟尿嘧啶，并在肿瘤组织中代谢为5-氟尿嘧啶，从而抑制核苷酸的合成，发挥抗肿瘤作用。肿瘤组织中5-氟尿嘧啶的浓度是血液中的100倍以上，靶向性好，不良反应轻微，且大部分患者都可耐受[4]。手足综合征（HFS）是服用Cap后出现的常见药物不良反应，多为1～2级，少数达到3级。临床主要表现为进展性症状变化，早期症状主要发生在手掌和足底，出现不同程度的瘙痒，指尖、手掌和足底充血，之后会持续发展为手掌和足底的暗红和肿胀，随后产生水泡，最终发展为脱皮，极大影响患者用药依从性及生存质量，成为后期持续治疗效果不佳的严重因素之一[5]。Cap导致HFS的发病机制尚不清楚，但病理特征表现为不同程度的细胞点片坏死、轻度的海绵状水肿、血管扩张、表皮与真皮交界处有炎性渗出。有研究表明[6-8]，显微镜镜下观察到血管舒张和水肿，类似于炎症反应，而炎症发生时，活跃的炎症因子主要有白介素类中的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23，肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素（IFN-γ）、C-反应蛋白（CPR）以及趋化性细胞因子（CCL-5）。因此，本研究对出现HFS的结直肠癌患者血浆中的主要炎症因子进行考察，推测其中涉及到的炎症因子，建立炎症因子含量变化与HFS发生的相关性，为Cap发生HFS的防治提供一定参考。
1. 材料和方法
1.1 一般资料
选取2018年9月至2019年2月海军军医大学附属长征医院普外科接受卡培他滨化疗方案的35例结直肠癌患者作为本次研究对象。纳入标准：①年龄≥18周岁；②经临床确诊为结直肠癌的患者；③接受了以Cap为基础的化疗；④预计生存期≥3个月，无主要器官的功能障碍；⑤有化疗指证，包括心肝肾等脏器功能正常，骨髓造血功能正常；⑥治疗前病情评估应有完整的体格检查和实验室检查，包括全血细胞计数、生化功能检查等；⑦生活质量：首次出现先写中文名（KPS）评分≥60分；⑧自愿签署知情同意书。排除标准：①孕、哺乳期患者；②5年内患过其他恶性肿瘤者；③经临床确定，对FU类药物过敏或严重代谢不良的患者；④有严重感染的患者；⑤经临床确定，患有其他会影响实验结果的恶性疾病；⑥不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效，或资料不全等影响疗效或安全性判断者。HFS事件评价标准：根据美国卫生及公共服务部2009年出版的常见不良反应事件评价标准4.0（CTCAE v4.0）分级，1级：轻微皮肤改变或皮肤炎（红斑、水肿、角化过度、不痛）；2级：皮肤改变（剥落、水泡、出血、肿胀、角化过度），疼痛，影响工具性日常生活活动；3级：重度皮肤改变（剥落、水泡、出血、水肿、角化过度），疼痛，个人自理能力受限。自患者服用Cap后进行临床观察，直到患者出现HFS后停止，收集患者出现HFS时的血液样本，采用EDTA-3K抗凝管采集血样，储存于−80 ℃冰箱冻存。本研究经过海军军医大学附属长征医院伦理委员会批准，35例患者基本信息及HFS信息见表1。
表 1 患者一般资料及HFS分级情况例数 性别 年龄（岁） 肿瘤部位 HFS分级 男 女 均值 中位数 直肠 结肠 未发生 1级 2级 3级 35 23 12 55.9 61 14 21 12 16 3 4 （65.7%） （34.3%） — — （29.9%） （70.1%） （34.2%） （45.7%） （8.5%） （11.4%） 1.2 仪器和耗材
Human IL-6 ELISA kit试剂盒、 Human IL-1β ELISA kit试剂盒、Human IL-10 ELISA kit试剂盒、Human IL-12p70 ELISA kit试剂盒、Human IL-17/IL-17A ELISA kit试剂盒、Human IL-23 ELISA kit试剂盒、Human IFN-γ ELISA kit试剂盒、Human CRP ELISA kit试剂盒、Human TNF-α ELISA kit试剂盒以及Human RANTES ELISA kit试剂盒均购自国润医疗供应链服务（上海）有限公司。酶标仪（Biotek，型号：800TSI）购自美国伯腾仪器（北京代表处）有限公司。37 ℃孵箱（型号：FYL-YS-151L，温度：0 ℃~100 ℃）由北京福意电器有限公司提供。
1.3 炎症因子指标检测方法
参照试剂盒说明书测定35例结直肠癌患者服用卡培他滨后血浆中各炎症因子包括白介素类中的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23， TNF-α，IFN-γ，CPR和CCL-5含量水平。将血液样本4 000 r/min离心15 min, 收集血浆样本，按照试剂盒说明书测定各炎症因子的含量。
1.4 统计学方法
使用 Microsoft Excel 软件进行统计结果分析，采用Graphpad Prism 8.3.0作图。
2. 结果
2.1 标准曲线
IL-23标准曲线的浓度为2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25 pg/ml；IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-12标准曲线的浓度为1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/ml；CCL-5、IL-1β的标准曲线的浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8 pg/ml；IL-6、CRP的标准曲线的标准品浓度为200、150、50、25、12.5、6.25、3.125 pg/ml；IL-10的标准曲线的浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 pg/ml。各炎症因子标准曲线呈现良好线性关系，可为样本的检测提供阳性对照，见表2。
表 2 炎症因子线性范围及标准曲线炎症因子 线性范围pg/ml 标准曲线 r IL-23 0～2 000 Y=594.66X−23.268 0.994 8 IFN-γ 0～1 000 Y=384.31X+7.9709 0.999 3 IL-17 Y=1379X−12.849 0.997 9 TNF-α Y=352.02X+5.7229 0.999 7 IL-12 Y=448.55X+8.5172 0.994 6 CCL-5 0～500 Y=168.42X−12.215 0.997 2 IL-1β Y=206.82X−4.5823 0.999 6 IL-6 0～200 Y=67.278X−6.6851 0.996 7 CRP Y=90.523X -3.228 0.990 5 IL-10 0～50 Y=27.541X−0.403 0.997 5 2.2 样本实测
35例服用Cap后未发生与发生各级HFS的两类结直肠癌患者，其血浆中各炎症因子含量水平见表3。结果显示，不同级别的HFS各炎症因子含量存在一定的差异性，提示Cap诱发HFS会导致血浆中不同炎症因子相互作用发生级联反应。其中，TNF-α 的含量水平在发生HPS呈整体下调状态，且明显低于未发生者的含量水平。其余炎症因子含量水平变化则无规律可循（图1）。
表 3 不同分级HFS患者中的各炎症因子含量测定结果（pg/ml，$\bar x $ ±s）炎症因子 未发生 1级 2级 3级 浓度平均值 标准差 浓度平均值 标准差 浓度平均值 标准差 浓度平均值 标准差 IL-1β 83.64 203.67 60.98 180.17 8.96 5.03 303.17 303.50 IL-6 19.57 52.35 12.29 31.84 4.68 0.34 22.60 25.96 IL-10 8.280 17.19 10.53 26.67 0.17 0.11 0.10 0.03 IL-12 67.80 148.40 99.40 282.18 22.87 9.42 195.11 250.89 IL-17 316.96 807.82 413.09 1118.61 76.79 46.93 905.52 1361.64 IL-23 218.06 566.46 190.55 542.33 12.11 5.95 663.67 911.80 IFN-γ 89.87 248.25 77.82 209.39 17.36 5.01 274.05 392.16 CRP 52.99 85.03 65.77 91.81 6.91 3.49 157.98 114.55 TNF-α 221.01 461.14 58.98 186.95 2.67 2.51 2.64 1.54 CCL-5 98.11 30.01 87.84 20.60 101.78 19.20 85.93 15.49 注：未发生HFS 12例；1级HFS 16例；2级HFS 3例；3级HFS 4例 
图 1 样本中各个炎症因子含量检测结果分布情况A. TNF-α，IL-12，IL-10，CRP含量；B. IL-1β，TNF-γ含量；C. IL-17，IL-23含量；D. IL-6，CCL-5含量3. 讨论
随着结直肠癌发病率的上升，Cap的临床应用越来越广泛，其带来的不良反应也急剧增加，其中，HFS严重影响患者生活质量以及用药依从性，更甚者则终止治疗，故必须对Cap诱发HFS进行药学监护[9-10]。临床常见的监护策略主要有减少给药剂量、中断药物治疗以及使用其他药物（如塞来昔布胶囊200 mg，po，bid +尿素乳膏涂抹患处，tid）干预HFS严重程度等方法。肿瘤坏死因子（TNF-α）是机体重要的炎性细胞因子之一，具有多生物学效应及生理病理性功能，且TNF-α在HFS发生的不同程度时血浆中含量有显著变化，推测TNF-α 血浆中含量水平越低发生HFS的程度越严重，并在进行药学监护时具有一定参考价值。
本实验以HFS为主要研究方向，对患者血浆中炎症因子进行检测，结果发现Cap诱发不同程度HFS血浆中的炎症因子含量有一定的差异性。由于临床化疗治疗医生很少让患者的HFS进展到2、3级再进行处理，所以患者例数较少，数据不能支撑比较。但对未发生与1级HFS比较发现，1级HFS患者血浆中IL-1β、IL-6、IL-23、IFN-γ、TNF-α、CCL-5的含量明显低于未发生HFS患者；而IL-10、IL-12、IL-17、CRP血浆中含量明显高于未发生HFS患者，且TNF-α浓度水平变化较为明显。目前，Cap诱发HFS的发生机制尚不清楚，可能是多途径炎症因子相互作用的结果。因此，关注定血浆炎症因子含量水平变化，在一定程度上可以反应Cap诱导HFS的严重程度，通过测定血浆中炎症因子含量的变化，有利于防治Cap诱发HFS情况，并对临床有重要的指导意义。
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表 1 川芎挥发油化学成分
序号 TR/min 化合物 分子式 相对含量（%） 水蒸气蒸馏 超临界CO2萃取 1 5.66 α-蒎烯 C10H16 1.48 0.09 2 6.52 β-蒎烯 C10H16 5.70 0.30 3 7.71 邻伞花烃 C10H14 1.63 0.05 4 8.60 α-松油烯| C10H16 3.99 0.14 5 9.40 4-甲基-3-（1-甲基亚乙基）-1-环己烯 C10H16 3.66 0.21 6 11.43 1,3,5-十一碳三烯 C11H18 5.04 0.30 7 12.02 4-松油醇 C10H18O 3.56 0.05 8 20.91 4-异丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4α，7-四氢化萘 C15H24 1.31 0.22 9 23.21 γ-古芸烯 C15H24 6.11 0.85 10 23.56 β-马榄烯 C15H24 2.14 0.34 11 26.56 桉油烯醇 C15H24O 0.66 0.11 12 29.15 丁基苯酞 C12H14O2 1.31 0.89 13 29.93 丁烯基苯酞 C12H12O2 2.32 0.97 14 30.73 6-丁基-1,4-环庚二烯 C11H18 0.45 0.60 15 31.83 洋川芎内酯A C12H16O2 9.53 25.60 16 32.02 - - 1.97 2.95 17 32.33 Z-藁本内酯 C12H14O2 45.40 65.59 18 33.86 E-藁本内酯 C12H14O2 0.49 0.75 注：-表示未鉴定 
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