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头癣、体癣、手癣等皮肤病多由浅部真菌感染引起,发病率高,可达全部皮肤病的25%左右。常用的市售制剂存在多个问题,首先,药效不全面。浅部真菌感染常合并有细菌感染[1-2],因此单纯给予抗真菌药物无法根治疾病。其次,耐药性。市售复方酮康唑乳膏虽然结合了抗真菌和抗细菌药物,但选用的硫酸新霉素易导致细菌产生耐药性。最后,皮肤安全性。为产生抗过敏作用,市售复方酮康唑乳膏中添加了丙酸氯倍他索,但易导致皮肤烧灼感、瘙痒刺痛和皮肤萎缩,长期大面积用药可导致高血糖、尿糖等不良反应[3]。对此,前期研究制备并优化了新型复方酮康唑软膏,含有酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松[4]。其中,莫匹罗星是新型抗菌药物,通过结合细菌异亮氨酸转RNA合成酶,阻断异亮氨酸的供给,导致细菌死亡,具有广谱、高效、不易发生过敏、不易发生交叉耐药和多重耐药等优势[5-6]。糠酸莫米松属于强效糖皮质激素,皮肤不良反应极为少见。
在此基础上,本课题重点研究自制的复方酮康唑软膏的体外抑菌作用,并对其皮肤刺激性和变态反应进行考察,从而证明自制制剂的有效性和安全性,并说明选择3种药物的合理性。
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参考前期研究制备软膏[4],酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的含量依次为2%、2%和0.1%。同时,制备缺酮康唑的阴性对照软膏、缺莫匹罗星的阴性对照软膏分别用于抗真菌试验、抗细菌试验。
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取直径9 cm的培养皿,加入20 ml培养液,制成培养基平板。细菌用营养琼脂培养基,37 ℃培养1~3 d;真菌用沙堡弱培养基,28 ℃培养5~7 d。菌落形成后,挑取一定量的菌落,加入1 ml灭菌蒸馏水,充分混合均匀。采用紫外分光光度计调整菌悬液浊度为0.5,相当于5×10 CFU/ml。用无菌棉签蘸取菌悬液,均匀涂布于实验用培养基平皿表面。
采用定性滤纸制成直径7 mm的圆形纸片、经灭菌,尔后分别浸入空白软膏(不含药)、自制复方酮康唑软膏、以及市售的复方酮康唑乳膏、酮康唑乳膏和莫匹罗星软膏的甲醇溶液中,待药液完全浸润纸片后,取出纸片放置于已涂布菌悬液的培养基表面。细菌置隔水式恒温培养箱37 ℃培养3 d,真菌置霉菌培养箱28 ℃培养7 d。观察各药敏纸片周围抑菌圈,并测定其直径值(长径与短径的平均值, mm),每株菌同时做3个平板。
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实验计量数据用平均值±标准差(
${{\overline x}}\pm s$ )表示,采用SPSS 19.0统计软件对数据进行单因素方差分析(两两间比较用LSD法),以P<0.05表示有统计学差异[7-9]。 -
实验结果表明,莫匹罗星软膏和空白软膏的纸片均被真菌包围,而其余3种制剂的纸片均产生了明显的抑菌圈。自制软膏、市售的酮康唑乳膏和复方酮康唑乳膏的抑菌圈直径相当(P>0.05),对不同真菌的抑菌圈直径大小为:断发毛癣菌>石膏样小孢子菌>裴氏着色真菌>须癣毛癣菌>犬小孢子菌>红色毛癣菌。由此可知,各制剂的抑菌圈直径大小顺序为:自制复方酮康唑软膏=复方酮康唑乳膏=酮康唑乳膏>莫匹罗星软膏=阴性对照软膏。提示自制复方酮康唑软膏对真菌的抑菌活性与市售单成分酮康唑乳膏、复方成分的复方酮康唑乳膏相当,结果见表1。
真菌 自制制剂复方酮康唑软膏 市售制剂 缺酮康唑阴性对照软膏 酮康唑乳膏 复方酮康唑乳膏 莫匹罗星软膏 须癣毛癣菌 32.14±0.74 32.34±0.42 32.55±0.38 7.00±0.00 7.00±0.00 红色毛癣菌 17.15±0.15 17.11±0.18 16.99±0.03 7.00±0.00 7.00±0.00 断发毛癣菌 48.02±0.04 48.23±0.17 48.16±0.14 7.00±0.00 7.00±0.00 犬小孢子菌 30.06±0.05 30.03±0.06 29.97±0.19 7.00±0.00 7.00±0.00 石膏样小孢子菌 38.10±0.07 38.05±0.15 38.08±0.09 7.00±0.00 7.00±0.00 裴氏着色真菌 34.07±0.35 33.84±0.57 34.04±0.10 7.00±0.00 7.00±0.00 -
在2种细菌的培养皿中,各组对铜绿假单胞菌均未产生抑菌圈;对金黄色葡萄球菌,空白软膏和市售的酮康唑乳膏未产生抑菌圈,其余制剂产生了明显的抑菌圈。自制软膏与市售莫匹罗星软膏的抑菌圈直径均为20 mm左右(P>0.05),且均显著大于复方酮康唑乳膏(P<0.01)。由此可知,各制剂的抑菌圈直径大小顺序为:自制酮康唑软膏=莫匹罗星软膏>复方酮康唑乳膏>酮康唑乳膏=阴性对照组软膏,结果见表2。
细菌 自制制剂复方酮康唑软膏 市售制剂 缺莫匹罗星阴性对照软膏 酮康唑乳膏 复方酮康唑乳膏 莫匹罗星软膏 金黄色葡萄球菌 20.76±0.14 7.02±0.01 13.19±0.08 20.74±0.09 7.01±0.01 铜绿假单胞菌 7.00±0.00 7.01±0.02 7.01±0.01 7.00±0.01 7.01±0.01 -
取雌雄各半的健康家兔4只,于试验前24 h,在家兔背部脊柱两侧对称划定左、右各3 cm×3 cm的相同区域。用电剪刀剔除兔毛后,用硫化钠溶液进行脱毛处理,并于脱毛24 h后,检查去毛处皮肤是否损伤,排除损伤皮肤。采用同体左右侧自身对比法,设给药组(自制复方酮康唑软膏)与对照组(空白软膏)。家兔背部左侧皮肤涂布空白软膏,右侧皮肤涂布0.5 g复方酮康唑软膏,然后用一层玻璃纸和二层纱布覆盖,再用胶布和绷带加以固定。
采用封闭实验,贴敷时间为4 h。实验结束后除去受试药品并用温水清洁给药部位,在自然光线下观察皮肤反应。于清洗后的1、24、48、72 h观察涂抹部位皮肤反应,按表3进行皮肤刺激反应评分,并计算受试动物积分的平均值,按表4判断皮肤刺激强度。
皮肤反应 具体表现 分值 红斑和
焦痂无 0 非常轻的红斑,勉强可见 1 明显的红斑 2 中度至重度的红斑 3 重度红斑(鲜红色)至轻度焦痂形成(深层损伤) 4 水肿 无 0 非常轻度的水肿,勉强可见 1 轻度水肿(边缘清晰) 2 中度水肿(皮肤隆起约1 mm) 3 重度水肿(皮肤隆起大于1 mm,超过涂抹区域) 4 积分均值 强度 0~<0.5 无刺激性 0.5~<2.0 轻刺激性 2.0~<6.0 中刺激性 6.0~8.0 强刺激性 观察发现,实验组仅有1只家兔出现勉强可见的轻微红斑,其余均未出现红斑、充血、水肿等刺激症状。根据表3评分,对照组皮肤刺激反应平均积分值为0,而实验组的分值小于0.5(表5),根据表4可认为复方酮康唑软膏单次给药对皮肤无刺激性。
时间 (h) 对照组 实验组 No.1 No.2 No.3 No.4 总积分 平均分 No.1 No.2 No.3 No.4 总积分 平均分 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0.25 48 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0.25 72 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0.25 -
多次刺激性试验中家兔的处理方法和初次给药方法与“2.3.1”项下相同,不同的是,对照组和给药组每天涂抹1次,给药时间持续涂抹14 d。从第2天开始,每次涂抹前修剪毛,用温水清除残留受试物1 h后观察,按表3评分。最后按公式每天每只动物平均积分=红斑和水肿积分总和/(受试动物×14),计算平均积分,以表4判断皮肤刺激强度分级。
多次给药后定期观察发现,对照组的家兔在各时间均未出现红斑、充血和水肿等皮肤刺激。实验组有2只家兔在8、12、13和14 d时出现极轻微的红斑,平均分值为0.25,在其余时间所有家兔无红斑、充血等刺激症状(表6),根据表4可认为复方酮康唑软膏多次给药对皮肤无刺激性。
时间(d) 左侧 右侧 No.1 No.2 No.3 No.4 总积分 平均分 No.1 No.2 No.3 No.4 总积分 平均分 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0.25 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0.25 13 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0.25 14 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0.25 -
采用豚鼠为试验动物,试验前约24 h,将豚鼠背部左侧2 cm×2 cm区域的毛剔短后,用硫化钠溶液进行脱毛处理。脱毛后24 h,检查去毛处皮肤是否损伤,有损伤的皮肤不宜进行试验。
试验分为2个阶段,首先在诱导接触阶段,将约0.5 g样品涂于豚鼠皮肤上,用一层玻璃纸和二层纱布覆盖,再以胶布封闭固定6 h;第7天和14天同法重复一次。在激发接触阶段,于末次诱导接触后14~28 d,将约0.2 g的样品涂于豚鼠背部右侧2 cm×2 cm去毛区(接触前24 h脱毛),然后用一层玻璃纸和二层纱布覆盖,再以无刺激胶布固定6 h。激发接触后24 h和48 h观察皮肤反应,按表3评分,当受试组动物出现皮肤反应积分≥2时,认为该动物出现皮肤变态反应(阳性),按表7判定受试物的致敏强度。
致敏率(%) 分级 过敏反应强度 0~8 Ⅰ 弱致敏 9~28 Ⅱ 轻度致敏 29~64 Ⅲ 中度致敏 65~80 Ⅳ 强致敏 81~100 Ⅴ 极强致敏 将豚鼠随机分为3组,实验组和阳性对照组均含20只豚鼠,阴性对照组含10只豚鼠。实验组采用上述的复方酮康唑软膏,阳性对照组和阴性对照组的处理方法与实验组基本相同,但阳性对照组采用2,4-二硝基氯代苯为样品,而阴性对照组在诱导接触时不给予任何样品,在激发接触时给予自制复方酮康唑软膏。实验结果如表8所示,自制复方酮康唑软膏致敏率为0,无皮肤变态反应。
组别 动物数(只) 观察时间(h) 皮肤反应强度评分 阳性动物数(只) 致敏率(%) 0 1 2 3 4 阴性对照 10 24 10 0 0 0 0 0 0 48 10 0 0 0 0 0 0 给药组 20 24 20 0 0 0 0 0 0 48 20 0 0 0 0 0 0 阳性对照 20 24 3 3 11 3 0 14 70 48 2 4 13 1 0 14 70 -
在单次、多次刺激性试验和皮肤变态反应试验之后,将试验动物处死,并取左右侧皮肤,经4%多聚甲醛固定、脱水、透明、浸蜡、包埋及切片后,进行HE染色,最后在倒置相差显微镜下观察皮肤。如图1、2、3所示,在单次、多次刺激性试验和皮肤变态反应试验中,给予自制软膏后,皮肤的各层结构完整,与对照组的正常皮肤组织基本一致。