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地龙参麦口服液(曾用名:健心乐口服液)是由地龙、红参、黄芪、麦冬、五味子等五味中药材加工制成的复方非标准制剂,具有利尿、降压、强心、补益气血、养心安神之功效[1-2],在临床上用于各种病因引起的慢性心功能不全、心慌、胸闷、胸痛及各种心律失常,并有利水、抗凝、营养心肌之功效。原质量标准制定年代久远,只有检查项,不能全面控制制剂质量。根据全军医疗机构制剂标准提高课题要求,增加了麦冬、黄芪和五味子的薄层色谱(TLC)鉴别方法。五味子醇甲是方中五味子的有效成分之一,能够保护心肌结构和功能,降低心肌耗氧量,延长供体心的保存时间[3];羟苯乙酯为方中的化学防腐剂,具有广谱抑菌作用,但过量使用会产生变态反应以及类激素作用[4]。为保证制剂的有效性和安全性,本研究采用HPLC法同时测定制剂中有效成分五味子醇甲和防腐剂羟苯乙酯的含量,为提高和完善地龙参麦口服液的质量标准提供可靠的试验依据。
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取本品30 ml,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20 ml,合并正丁醇液,用1%氢氧化钠溶液洗涤3次,每次20 ml,再用水洗涤2次,每次20 ml,分取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1 ml使溶解,作为供试品溶液。另取缺黄芪的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。取黄芪对照药材2.0 g,加水饱和的正丁醇60 ml,加热回流30 min,放冷,滤过,滤液同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作为对照品溶液。按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验,吸取上述4种溶液各10 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以二氯甲烷-甲醇-水(25∶11∶3)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示,供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰,见图1。
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取本品20 ml,加30%盐酸溶液3 ml,加热煮沸5 min,放冷,用二氯甲烷振摇提取2次,每次30 ml,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1 ml使溶解,作为供试品溶液。另取缺麦冬的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。取麦冬对照药材2 g,加水50 ml,煎煮30 min,滤过,滤液加30%盐酸溶液6 ml,同法制成对照药材溶液。按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验,吸取上述3种溶液各10 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以二氯甲烷-丙酮(12∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰,见图2。
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取本品30 ml,用二氯甲烷振摇提取2次,每次30 ml,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加二氯甲烷1 ml使溶解,作为供试品溶液。另取缺五味子的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。取五味子对照药材1.0 g,加二氯甲烷30 ml,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加二氯甲烷1 ml使溶解,作为对照药材溶液。再取五味子醇甲对照品,加二氯甲烷制成每1 ml含1 mg五味子醇甲的溶液,作为对照品溶液。按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验,吸取上述4种溶液各2 μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚(30~60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(10∶7∶1)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯(254 nm)下检视。结果显示,供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性对照无干扰,见图3。
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色谱柱为Wondasil C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0~10 min,35%A;10~20 min,35%A→47%A;20~30 min,47%A→55%A。流速:1.0 ml/min;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μl。
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(1)混合对照品溶液:精密称取羟苯乙酯、五味子醇甲对照品各适量,加甲醇溶解并定容,制成每1 ml含羟苯乙酯、五味子醇甲分别为505.89、116.12 µg的混合对照品储备液。精密量取上述混合对照品储备液2 ml,置于10 ml量瓶中,加甲醇定容,摇匀,即得羟苯乙酯、五味子醇甲质量浓度分别为101.18、23.22 µg/ml的混合对照品溶液。
(2)供试品溶液:精密量取样品2 ml,置于10 ml量瓶中,加50%甲醇溶液定容,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
(3)阴性对照溶液:分别取缺羟苯乙酯、缺五味子的阴性样品,按照供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。
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精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,见图4。结果表明,在该色谱条件下,供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处出峰,阴性对照溶液对羟苯乙酯、五味子醇甲的测定无干扰。
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精密量取“2.2.2”项下混合对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml,分别置于10 ml量瓶中,加50%甲醇溶液定容,摇匀,进样,记录峰面积。以羟苯乙酯和五味子醇甲质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得羟苯乙酯回归方程为Y=58 559.18X−90 593.32 (r=0.999 9),五味子醇甲回归方程为Y=27 155.08X−7 196.072 (r=0.999 9)。结果表明,羟苯乙酯和五味子醇甲检测质量浓度线性范围分别为25.29~252.94、5.81~58.06 μg/ml。
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取“2.2.2”项下混合对照品溶液,连续进样测定6次,记录峰面积。结果显示,羟苯乙酯和五味子醇甲峰面积的RSD分别为0.62%、0.45%,表明仪器精密度良好。
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取已知含量的供试品溶液,分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按进样测定,记录峰面积。结果显示,羟苯乙酯和五味子醇甲峰面积的RSD分别为1.03%、0.85%,表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。
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取同一批样品,平行制备6份供试品溶液,进样测定,记录峰面积并计算样品含量。结果显示,羟苯乙酯和五味子醇甲的含量平均值分别为0.468 8、0.115 6 mg/ml,RSD分别为0.75%、0.85%(n=6),表明本方法重复性良好。
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精密量取已知含量的样品(批号:170328)1.0 ml,共9份,分别置于10 ml量瓶中,各加入低、中、高质量的羟苯乙酯和五味子醇甲对照品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算加样回收率,结果见表1。
成分 样品量(m/mg) 加入量(m/mg) 测得量(m/mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 羟苯乙酯 0.468 8 0.252 9 0.717 6 98.38 99.72 0.76 0.468 8 0.252 9 0.719 1 98.97 0.468 8 0.252 9 0.721 9 100.08 0.468 8 0.505 9 0.976 3 100.32 0.468 8 0.505 9 0.970 9 99.25 0.468 8 0.505 9 0.972 6 99.58 0.468 8 0.758 8 1.231 9 100.57 0.468 8 0.758 8 1.232 2 100.61 0.468 8 0.758 8 1.225 3 99.70 五味子醇甲 0.115 6 0.058 1 0.172 6 98.11 99.35 1.02 0.115 6 0.058 1 0.172 7 98.28 0.115 6 0.058 1 0.173 2 99.14 0.115 6 0.116 1 0.230 0 98.54 0.115 6 0.116 1 0.230 6 99.05 0.115 6 0.116 1 0.232 6 100.78 0.115 6 0.174 2 0.288 5 99.25 0.115 6 0.174 2 0.291 1 100.75 0.115 6 0.174 2 0.290 2 100.23 -
取3批样品各适量,分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算样品含量,结果见表2。
样品批号 羟苯乙酯 五味子醇甲 160903 0.437 1 0.102 6 170112 0.531 9 0.106 1 170328 0.468 8 0.115 6