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非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌中最常见的组织学类型,发病率逐年增高,无论是在我国还是全球,都已成为致死率最高的癌症之一[1]。因此,对于NSCLC的防治,特别是探索新的化学预防策略显得尤为重要。目前新兴出现的以靶向和免疫疗法为手段治疗NSCLC越来越引人关注,尽管如此,对于肺癌的治疗同样也面临着研发新型抗癌药物的挑战,包括研发过程中所需巨额费用和时间,而重新使用具有潜在癌症治疗的非抗癌药物用于癌症治疗,不仅可以节省研发新药所需的人、财、物力,甚至还可能提高治疗效果。临床前研究和数据证实许多非抗癌药物具有潜在的预防和治疗癌症的作用,譬如对NSCLC的预防和治疗,这些药物就有阿司匹林、他汀类药物等[2]。
阿司匹林和阿托伐他汀是广泛用于心血管疾病的一线防治用药。近年来,它们已经被证实可能成为新兴的、可用于不同类型肿瘤(包括NSCLC)的化学预防药物[3-5]。尽管它们抗NSCLC的确切分子机制尚需要进一步研究,但文献报道其抗肿瘤作用机制存在重叠,即均可靶向作用于mTOR和NFκB通路。据此我们假设:阿司匹林和阿托伐他汀联合使用可通过共同抑制mTOR和NFκB通路而发挥协同抗NSCLC效应。为验证假设,本实验选取了非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞,在体外研究阿司匹林联合阿托伐他汀对它们细胞增殖的影响及其相关作用机制,期望在应用阿司匹林和阿托伐他汀防治心血管疾病的同时可以降低NSCLC的患病风险,以及为设计新型控制NSCLC的干预策略提供理论依据。
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人非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞(美国Manassas公司),培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(美国Sigma-Aldrich公司),置37 ℃饱和湿度、5% CO2培养箱孵育。阿司匹林和阿托伐他汀标准品化合物(美国Sigma-Aldrich公司),用DMSO溶解后−20 ℃保存。RNA提取试剂盒购自上海博彩生物科技公司,BCA法蛋白定量试剂盒和TNF-α和IL-1β反转录试剂盒购自美国Thermo scientific公司,SYBR qPCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。mTOR、p-mTOR、NFκB、p-NFκB、Bcl-2、Mcl-1、β-Actin抗体以及鼠、兔二抗购自美国CellSignal公司。其他试剂以及仪器设备由本实验室提供。
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分别取对数生长期非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞,用胰酶-EDTA消化并计数,将100 μl的细胞混悬液接种于96孔培养板使每孔的细胞数约为5×103个/100 μl。待24 h后细胞贴壁,加入阿司匹林或/和阿托伐他汀(先用DMSO溶解再用DMEM培养液稀释成不同浓度)。使与细胞作用的阿司匹林浓度分别为0、5、50、100、150、200 μmol/L,阿托伐他汀浓度分别为0、1、2、5、10、20 μmol/L。每个浓度设3个复孔,对照组加入DMEM培养液。置于37 ℃、5% CO2培养箱72 h后,加入10 μl MTS溶液(临用前用PBS溶解,pH7.4,质量浓度为5 g/L),再置培养箱继续培养1 h,于酶标仪490 nm处检测吸光度值(A值)。
细胞增殖存活率(%)=(实验孔A值/对照孔A值)×100。
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分别将A549和NCI-H460细胞悬液接种于两个6孔培养板中,保证每孔细胞数约为1×105个/孔,次日待细胞贴壁铺满后进行划痕,PBS清洗一遍后更换无血清培养液。根据MTS实验结果选取了浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物,共设3个给药组和1个对照组进行实验,24 h后观察划痕距离变化并在显微镜下拍照,与给药前进行比较。
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以1×105个/孔接种NCI-H460细胞于6孔板中,同样设置有浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合的3个药物处理组和1个对照组,并给予对应浓度的药物处理细胞,对照组不作处理。继续培养72 h后收集细胞,PBS洗细胞3次,加入细胞裂解液(含20 mmol/L Tris-Hcl/pH 7.5、1% Triton、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、2.5 mmol/L 无水焦硫酸钠、1 mmol/L β-甘油磷酸盐、1 µg/ml亮肽素和1 mmol/LPMSF),用细胞刮刀将细胞刮下,4 ℃冰浴中超声破碎细胞,待细胞膜破碎反复涡旋后,于4 ℃、12 000 r/min离心,取上清,BCA法蛋白定量后样品经SDS-PAGE分离,蛋白电转至PVDF膜,将PVDF膜在5%牛奶中封闭1 h,加入1∶1 000的一抗,4 ℃孵育过夜,PBS洗涤,加入酶标二抗室温1 h,PVDF膜经ECL化学发光底物检测蛋白。
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以1×105个/孔接种NCI-H460细胞于6孔板中,设置有浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合的3个药物处理组和1个对照组。次日待细胞贴壁换培养液给予对应浓度的药物处理细胞,对照组不作处理,继续培养72 h后收集细胞。采用RNA提取试剂盒(上海博彩)提取细胞总RNA,按照TNF-α和IL-1β反转录试剂盒说明书(美国Thermo scientific公司)操作进行反转录。得到的cDNA按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书进行实时定量PCR检测。每个PCR反应体系包括:SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、cDNA模板2 μl、10 μmol/L上下引物(表1)各0.4 μl以及7.2 μl去离子水,总反应体积为20 μl,经7300 qRT-PCR系统(Applied Biosystems)检测,反应循环参数为95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s共40个循环。基因的表达用ΔΔCt法计算,以β-actin作为内参。
引物名称 引物序列(5’-3’) TNF-α 上游:ACCCTCACACTCAGATCATTCTTCTC 下游:CAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTC IL-1β 上游:CCAGCAGGTTATCATCATCATCC 下游:CTCGCAGCAGCACATCAA β-actin 上游:TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA 下游:CATCGGAACCGCTCGTTGCCAATAG -
使用SPSS 16.0软件进行数据处理,所有数据以(
$ \bar{x}\pm s $ )表示,采用t检验进行两组间差异比较,P<0.05为显著差异。