Optimization of total polyphenol purification from purple tea by macroporous resin

UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津）；AUX220型电子分析天平（精度：0.1 mg，日本岛津）；HH-2数显恒温水浴锅（江苏金坛市友联仪器研究所）。KQ-500B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

肯尼亚紫茶（批号：20181030，火烈鸟茶叶有限公司）；没食子酸对照品（批号：110831-201605，中国食品药品检定研究院）；铁氰化钾（温州市化学用料厂）；ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5型大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；氯化铁、盐酸、乙醇等试剂（西陇科学股份有限公司），以上试剂均为分析纯，水为纯化水。5种大孔吸附树脂的物理参数详见表1。

精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品28.4 mg，置于100 ml量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀制备成母液。精密吸取1 ml母液置10 ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配制成浓度为28.4 μg/ml的对照品溶液，置于冰箱中2～8 ℃避光保存。

称取紫茶粉末5.0 g，置于圆底烧瓶中，加入50%乙醇500 ml，加热回流提取30 min，放冷至室温，将药液滤过除去沉淀，滤液用50%乙醇补足减失的重量并稀释至500 ml。精密吸取1 ml稀释液，置于100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得。

分别精密吸取浓度为28.4 μg/ml的没食子酸对照品溶液0.2、0.3、0.5、0.8、1.0和1.2 ml于25 ml量瓶中，依次加入0.1 mol/L FeCl₃溶液1.0 ml、1%K₃[Fe（CN）₆]溶液2.0 ml和0.1 mol/L HCl溶液0.5 ml，用纯化水稀释至刻度，摇匀，于室温下避光放置60 min。以相应试剂为空白，在775 nm处测定吸光度。以没食子酸质量浓度（X，μg/ml）为横坐标，以吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.769 9X+0.027 3（r=0.999 7），表明没食子酸浓度在0.227～1.363 μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。方法学考察结果表明，专属性良好，平均回收率为100.28%，RSD为2.09%；精密度和重复性试验的RSD小于3%。显示本方法准确可靠。

取5种不同型号的大孔吸附树脂在95%乙醇中浸泡24 h，使其充分溶胀，将浸泡后的树脂装柱，用95%乙醇以5 ml/min的体积流量冲洗，直至流出液澄清，之后用2倍体积的4%盐酸溶液浸泡3 h，用纯化水以5 ml/min的体积流量冲洗至中性，再用2倍体积的5%氢氧化钠溶液浸泡3 h，用纯化水以5 ml/min的体积流量冲洗至中性，最后用95%乙醇浸泡保存，临用时以5 ml/min体积流量的纯化水冲洗至中性。

取预处理后的ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5型大孔吸附树脂约1 g，精密称定，共5份，置于50 ml具塞磨口锥形瓶中。加入质量浓度为50 μg/ml（以多酚含量计）的紫茶总多酚提取液20 ml，在30 ℃水浴的条件下振荡吸附24 h。吸附结束后，滤过，取续滤液按照“2.1”项下方法测定总多酚的含量，计算各树脂在30 ℃下对紫茶总多酚的吸附量和吸附率。然后，将上述吸附饱和的大孔树脂取出，用纯化水清洗后，分别加入70%乙醇20 ml，在30 ℃水浴的条件下振荡24 h，进行静态解吸，计算其解吸率，结果见表2。计算公式如下：

吸附量=（C₀−C₁）V₁/M

吸附率=（C₀−C₁）/C₀

解吸量= C₂ V₂/M

解吸率=C₂ V₂/[（C₀−C₁）V]

其中，C₀、C₁为吸附前和吸附后吸附液中多酚的质量浓度，C₂为解吸附后多酚的质量浓度，V₁和V₂分别为吸附液和解吸液体积，M为大孔树脂的质量。

由表2结果可知，大孔树脂D301对紫茶总多酚具有较强的吸附效果，其吸附率达到100%，其余4种树脂的吸附率从高到低依次是X-5、AB-8、D101、ADS-17。由此可见，不同类型的树脂对紫茶总多酚的吸附性能各不相同。这可能是由于树脂的内部结构、分子极性以及多酚的溶解度等对树脂吸附多酚能力的影响。多酚由于分子中酚羟基的存在，其分子极性较低，因而在与极性较弱或者非极性的树脂进行吸附时效果更好。采用50%的乙醇进行解吸，可以看出5种树脂的解吸率差异较大，AB-8树脂的解吸效果最好，解吸率达86.73%，X-5树脂次之。综合紫茶总多酚提取液的静态吸附和解吸试验，AB-8型树脂和X-5型树脂对紫茶总多酚的吸附效果和解吸效果均较好，而AB-8型树脂价格相对低廉，从节省成本的角度考虑，优先采用AB-8型树脂对其进行纯化。

取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂约1 g，精密称定，共15份，分别置于50 ml具塞磨口锥形瓶中，加入质量浓度为50 μg/ml的紫茶总多酚提取液20 ml，在25 ℃水浴的条件下振荡吸附12 h，每隔一段时间取出1个磨口锥形瓶，测定其总多酚的质量浓度，计算对应时间的吸附率，绘制静态吸附动力学曲线。然后，采用静态解吸试验的方法处理已吸附结束的树脂，进行静态解吸动力学试验，同样每隔一段时间取出1个磨口锥形瓶，测定其总多酚的质量浓度，计算对应时间的解吸率，绘制静态解吸动力学曲线，结果见图1。

由图1可知，在测定的时间点内，AB-8型大孔吸附树脂对紫茶总多酚的吸附量随着时间的延长而逐渐增多，经过2.5 h以后，树脂对紫茶总多酚的吸附量趋于平衡，对应的吸附率为88.27%。在0～5 h内，树脂的解吸率呈上升趋势，并在4 h达到最大值84.86%，在随后的时间里，解吸率随着时间的延长变化不大。

取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂1 g，精密称定，共7份，分别置于50 ml具塞磨口锥形瓶中，分别加入质量浓度为50 μg/ml并用0.1 mol/L的盐酸和0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为2、3、4、5、6、7、8的紫茶总多酚提取液，在30 ℃水浴的条件下振荡吸附2.5 h，测定吸附液中紫茶总多酚的质量浓度，计算吸附率，结果见表3。

由表3可知，吸附液pH值对紫茶总多酚的吸附率有较大影响。在pH值为2时，AB-8型大孔吸附树脂对此质量浓度下的紫茶总多酚吸附率达89.79%。因此，确定上样液的pH值为2。

取预处理后的AB-8型树脂10 g，精密称定，室温下将质量浓度为250.0 μg/ml（调至pH为2）的紫茶总多酚提取液（供试品溶液用水稀释）以1.0 ml/min体积流量湿法加至树脂柱中，分段收集流出液，流出液每20 ml收集1份，测定吸光度，计算对应的总多酚含量，绘制泄露曲线。当流出液中总多酚的质量浓度达到上样液质量浓度的1/10，达到泄露点，认为此时为最佳上柱体积，结果见图2。在第2份流出液时，紫茶总多酚已经开始泄露，在第3份流出液中，总多酚的质量浓度为26.5 μg/ml，达到上样液质量浓度的1/10，因此选择上柱体积为60 ml，即3 BV。

取预处理好的AB-8型树脂10 g，精密称定，装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，共5份，分别加入质量浓度为250、375、500、625、750、1 000 μg/ml的上样液（pH为2）各60 ml（3 BV），以1.0 ml/min的流速上柱，收集流出液，按“2. 1”项下方法测定总多酚含量，计算各质量浓度下的吸附率，确定最佳上样质量浓度。结果显示，各上样质量浓度下的吸附率分别为74.50%、77.56%、69.77%、60.59%、56.73%、43.61%。由此可见，上样液质量浓度对大孔吸附树脂吸附性能有显著影响，在考察范围内吸附率总体呈现出先上升后下降的趋势。当质量浓度小于375 μg/ml时，随着上样液质量浓度增加，动态吸附率呈现上升的趋势；分析原因可能是在此较低的浓度范围内，紫茶多酚有较大的机会与大孔树脂的内表面接触，进而加速扩散至树脂孔道内，形成吸附作用。而当质量浓度大于375 μg/ml时，随着质量浓度继续增加，位于孔道内的紫茶总多酚分子的扩散运动受到抑制，导致树脂对多酚的吸附能力降低。因此，选择上样液质量浓度为375 μg/ml。

取预处理的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法上柱法装入1.5 cm ×20 cm的层析柱中，共4份，轻敲柱壁，使柱内树脂平衡，打开下端阀门，控制体积流量使柱内纯化水流出，在液面距树脂1 cm时，将紫茶总多酚上样液（质量浓度为375 μg/ml，pH为2，上样量为3 BV）分别以1.0、2.0、3.0、4.0 ml/min的体积流量上柱，同时收集下端流出液，测定吸光度，计算吸附率，确定最佳上样体积流量。结果显示，吸附率分别为79.37%、79.78%、72.73%、64.73%，当上样体积流量为2.0 ml/min时，AB-8型大孔吸附树脂对紫茶总多酚的吸附率最大，故选择上样体积流量为2.0 ml/min。

取预处理的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法上柱法装入1.5 cm ×40 cm的层析柱中，分别设置径高比（柱直径与树脂填充高度比值）为1∶6、1∶9、1∶12、1∶15，将紫茶总多酚上样液（质量浓度为375 μg/ml，pH为2）分别以2.0 ml/min的体积流量上柱，对应的药液上样量分别为3、4.5、6、9 BV，收集下端流出液，测定吸光度，计算吸附率，确定最佳径高比。结果显示，吸附率分别为79.81%、78.37%、76.73%、68.54%。径高比1∶6和1∶9对吸附率影响不大。此后，在考察范围内，随着径高比值的降低，吸附率也呈现下降的趋势，可能是由于树脂层过高导致上样液穿透能力差所致。

取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，共5份，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱（径高比为1∶6，下同），将质量浓度为375 μg/ml上样液（调节pH为2）3 BV以2.0 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，分别用纯化水及25%、50%、75%、90%乙醇溶液各3 BV以1.0 ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定其吸光度，计算解吸率，确定最佳洗脱剂体积分数。结果：解吸率分别为17.52%、62.96%、91.04%、81.41%、84.67%，由此可见，50%乙醇对紫茶总多酚的解吸作用最强，故选择洗脱剂的体积分数为50%。

取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，将375 μg/ml的上样液（pH为2）3 BV以2 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，用50%乙醇以1.0 ml/min的流速进行洗脱，洗脱溶剂用量分别为1、2、3、4、5 BV，收集洗脱液，测定其吸光度，计算洗脱率，确定最佳洗脱剂用量。结果：解吸率分别为54.68%、83.37%、90.29%、91.48%、91.45%，表明当50%乙醇用量在1～3 BV时，随着用量的增加，对紫茶总多酚的解吸率呈上升的趋势，随后继续增加洗脱剂的用量，解吸率不再增加，表明此时树脂上吸附的总多酚已被充分洗脱，没有必要再增加洗脱剂的用量，故确定洗脱剂的用量为4 BV。

取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂约10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，将375 μg/ml上样液（pH为2）3 BV以2.0 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，用50%乙醇溶液4 BV分别以1.0、2.0、4.0、6.0 ml/min的体积流量进行洗脱，计算解吸率，确定最佳体积流量。结果：对应的解吸率分别为92.47%、93.76%、91.97%、85.18%，表明紫茶总多酚的洗脱率随着洗脱体积流量的加大先升高后减小，故选择最佳洗脱体积流量为2 ml/min。

称取4份预处理后的大孔吸附树脂约10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm层析柱中（径高比为1∶6），将紫茶提取物预先用石油醚（60～90 ℃）除去脂溶性色素，参考“2.1.2”项下方法加水稀释以制备浓度为375 μg/ml（pH为2）的紫茶总多酚溶液3 BV（总多酚质量为22.5 mg，质量分数40.2%，干膏56.0 mg），并以2 ml/min体积流量上样，待吸附饱和后，先用3 BV水去除杂质，然后用50%乙醇溶液4 BV以2 ml/min的体积流量洗脱，分别收集洗脱液，按照紫茶总多酚定量测定方法，计算总多酚洗脱量及洗脱率，再将洗脱液水浴蒸干，低温烘至恒重，计算干膏的量；精密称取干膏适量，测定总多酚的含量。结果见表4。

由纯化工艺验证结果可见，经过4次验证试验，50%乙醇洗脱条件下总多酚的平均洗脱率为92.5%，紫茶总多酚干膏量由56.0 mg减少至平均29.9 mg，质量分数从40.2%升至平均69.8%，表明建立的纯化工艺对紫茶总多酚有较好的分离、纯化效果。

大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构和选择性吸附功能的高分子材料，目前已广泛应用于中药的活性成分如黄酮、皂苷、生物碱及多酚等成分的分离与纯化。其中，目前采用大孔树脂对多酚类成分进行纯化的有天麻总多酚^[9]、白簕叶总多酚^[10]、过岗龙总多酚^[11]、茶梗中茶多酚^[12]等，这都提示了大孔树脂精制多酚类有效成分的可行性。影响大孔树脂的分离纯化有多方面的因素，在选择合适的大孔树脂时，应综合考虑各种影响因素，如树脂的极性、比表面积以及上样液的质量浓度、洗脱液浓度等，以获得最佳的分离效果。在利用大孔树脂纯化时，应尽量滤去上样液中的沉淀，这样既能提高总多酚的纯化率，也能提高树脂的使用寿命。本研究中的样品采用50%乙醇提取后用纯化水进行稀释，当样品溶于水中时，由于多酚类物质能被大孔树脂吸附，而色素及多糖等物质不能吸附而被洗脱掉。而在改为乙醇洗脱时，树脂的吸附效果减弱，被吸附的多酚能被乙醇洗脱。

本研究通过对5种不同型号的大孔吸附树脂的吸附和解吸进行考察，确定了AB-8型大孔吸附树脂纯化紫茶总多酚的最佳工艺条件，为该产品的进一步开发奠定了基础。