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中药及其制剂由于其特殊的功效,低毒性和较少的副作用而在世界范围内越来越流行[1]。坤复康片是著名的中药配方,包括赤芍、苦参、香附、猪苓、女贞子、南刘寄奴、乌药、粉萆解、扁蓄,临床用于治疗中国女性的骨盆炎症[2-3]。红景天苷(图1)是坤复康片抗炎作用的重要生物活性化合物。研究证明,红景天苷包含许多药理作用,例如抗血栓[4]、抗成骨细胞凋亡[5]、保肝[6]和抗肿瘤[7]。
中药药动学研究不仅可以解释和预测有关功效和安全性的药物事件,而且还有助于评估处方或者中草药的合理性和相容性[8-10]。口服是应用中药的主要途径,并通过口服发挥药理作用。但是,口服坤复康片后,红景天苷的药动学特征尚未见报道。同时,坤复康片中其他成分对红景天苷吸收的影响目前也未被揭晓。
我们旨在开发一种选择性高、灵敏且快速的UPLC-MS/MS方法,用于测定大鼠血浆中的红景天苷。随后,本方法成功地用于该活性成分在大鼠体内的药动学研究。同时,通过比较大鼠口服给予红景天苷单体和坤复康片后的药动学行为,我们探究了坤复康片对红景天苷药动学特征的影响。
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在本研究中,我们尝试了各种流动相条件以获得分析物的最佳响应、合适的保留时间和良好的峰形。主要测试了甲醇、乙腈、0.1%甲酸和100%水作为潜在的流动相。结果表明,0.1%甲酸和甲醇作为流动相可以产生更高的响应和更好的峰形。因此,选择了甲醇-0.1%甲酸水。对于MS条件,测试了正扫描和负扫描模式。由于处于负离子模式的红景天苷显示出更明显的碎片特征和更高的灵敏度,因此选择了该模式。空白血浆、红景天苷和内标血浆的典型色谱见图2。其中,红景天苷和内标保留时间分别为1.52和1.98 min。在空白血浆中,没有发现内源性物质干扰红景天苷的分析。
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于空白大鼠血浆中加入对照品溶液配制成(5、50、200 ng/ml)3种浓度的对照品血浆溶液,每个浓度平行为6份,按“血浆预处理方法”项处理,进样,测定峰面积A1。另取6份空白大鼠血浆,按“血浆预处理方法”项处理后,加入按对照品溶液配制成(5、50、200 ng/ml)3种浓度的对照品血浆溶液,每个浓度平行为6份,进样,测定峰面积A2。计算A1/A2为提取回收率,分别为(87.2±6.2)%、(85.1±4.4)%、(90.4±7.1)%。内标葛根素的提取回收率为(91.2±5.9)%。结果表明红景天苷的提取回收率较高,且稳定。
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制备高、中、低浓度的质控样品,按“2.4”项下方法提取后进样分析。在3 d内测定日内精密度,通过准备各浓度下6份重复样本来评估日间精密度。从标准曲线计算出质控样品浓度,并对质控样品结果进行方差分析以获得精确度和准确性。结果见表1。几组样本的标准偏差和相对误差均在合理范围内,表明红景天苷的精密度和准确性良好。
浓度(ng/ml) 标准偏差(%) 相对误差(%) 日内 日间 日内 日间 5 2.74 4.76 −8.51 2.36 50 4.33 3.59 4.84 −4.55 200 4.29 1.98 3.57 −2.18 -
取空白大鼠血浆适量,配成含红景天苷4、5、10、20、50、100、200、500 ng/ml的标准空白血浆系列溶液。按“2.4”项下提取,每个浓度平行测定6份样本。以待测物红景天苷浓度为横坐标,待测物与内标葛根素峰面积的比值为纵坐标,进行线性回归,权重系数为1/C2,计算直线回归方程。红景天苷标准曲线为:Y=0.039 5X−0.013 1。其中,X为红景天苷的浓度(ng/ml),Y为红景天苷和内标质谱峰面积的比值。线性范围为4~500 ng/ml,红景天苷定量限为4 ng/ml。
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分别取低、中、高3个浓度的质控样本各6份,测定反复冻融3次、−20 ℃存放2周、室温(20 ℃)下存放4 h、自动进样器(4 ℃)保存24 h后药物的浓度,考察冻融和存放时间对红景天苷稳定性的影响,试验结果表明:红景天苷在上述条件下稳定,不影响测定结果。结果见表2。
条件 浓度(ng/ml) 标准偏差
(%)加入量 测得量 3次冻融 5 4.77 6.53 50 44.53 4.12 200 189.22 7.46 −20 ℃冷冻20 d 5 4.74 8.25 50 45.12 4.37 200 190.98 8.33 室温下(20 ℃)存放4 h 5 4.76 2.56 50 44.43 6.87 200 188.23 5.53 自动进样器(4 ℃)存放24 h 5 4.72 8.12 50 46.33 7.97 200 189.23 6.63 -
该方法用于大鼠口服红景天苷单体和坤复康片的药动学研究。图3和表3给出了通过DAS 2.0计算两组大鼠的平均浓度-时间曲线及其药动学参数的数据。浓度-时间曲线见图3。与红景天苷单体组相比,坤复康片组中cmax、AUC0−t和AUC0−∞的水平显著增加。
参数 红景天苷单体组 坤复康片组 t1/2 (t/h) 36.08±6.63 27.44±9.87 MRT (t/h) 16.11±0.82 15.97±0.61 CL[L/(kg·h)] 0.022±0.003 0.016±0.003 cmax (ng/ml) 85.81±15.66 143.86±46.91* AUC0−t (ng·h/ml) 587.11±35.02 956.35±47.65** AUC0−∞ (ng·h/ml) 917.61±121.43 1 296.47±249.32* tmax (t/h) 0.50±0.00 0.83±0.47 *P <0.05,** P <0.01,与红景天苷单体组比较。