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养血安神糖浆为陆军第七十二集团军医院（以下简称本院）自制制剂（批准文号：南制字（2016）B504019），由首乌藤、鸡血藤、熟地黄、合欢皮、墨旱莲、仙鹤草和生地制成，具有滋阴养血、宁心安神功效，临床用于精神倦怠、失眠健忘、肾虚腰酸、头晕乏力。首乌藤为方中君药，为蓼科植物何首乌的干燥根茎，具养血安神、祛风通络之功效，主含2,3,5,4’-四羟基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷[1]。处方中墨旱莲、仙鹤草、合欢皮中均含槲皮苷；墨旱莲、仙鹤草、熟地黄、生地中均含木犀草苷；墨旱莲、仙鹤草中均含芦丁[2-4]。槲皮苷、木犀草苷和芦丁均属于黄酮类化合物，具有免疫调节和抗氧化功能[5-6]。因此，将槲皮苷、木犀草苷和芦丁作为黄酮类成分的指标性成分进行整体质量控制。养血安神糖浆现行《卫生部颁药品标准中药成方制剂》[7]标准只有检查项，未收载含量测定方法，不利于质量控制。因此，笔者以安神作用突出的槲皮苷和葡萄糖苷，以及木犀草苷和芦丁为测定指标，建立同时测定4组分含量的HPLC法，填补了制剂无含量测定方法的空白，并为提高质量标准及工艺改进提供一定的研究基础。
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Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2489双波紫外可见光检测器，Empower 3工作站[沃特世科技（上海）有限公司]；756PC紫外可见光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；KQ2200DE型数控超声波清洗器（上海精若科学仪器有限公司）；Sartorius BS 124S型电子天平（德国赛多利斯）；80-2台式低速离心机（上海医疗器械有限公司手术器械厂）。
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2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（批号：110844-201109）、槲皮苷对照品（批号：111538-201606）、木犀草苷对照品（批号：111801-201003）和芦丁对照品（批号：100080-200707）均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用。养血安神糖浆（本院制剂室自制，规格：250 ml/瓶，批号：191008、191211、200309、200422、200519）；100%甲醇为色谱纯（德国默克股份两合公司），分析纯95%乙醇，水为重蒸去离子水，其他试剂均为分析纯。
1.1. 仪器
1.2. 试药
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①对照品储备液：精密称取槲皮苷、木犀草苷、芦丁对照品各10.0 mg，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品20.0 mg，分别置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成槲皮苷、木犀草苷、芦丁1 mg/ml的对照品储备液，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷2 mg/ml的对照品储备液。②对照品稀释液：分别精密量取槲皮苷、木犀草苷、芦丁、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品储备液各2 ml，加甲醇稀释至10 ml，制成含槲皮苷、木犀草苷、芦丁对照品稀释液各0.2 mg/ml，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品稀释液0.4 mg/ml。③混合对照溶液：分别精密量取4组分对照品稀释液各1 ml置5 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液即得。
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精密量取养血安神糖浆10 ml，加甲醇稀释至50 ml，超声（100 W，40 kHz）15 min，离心10 min(转速：4 000 r/min，离心半径12 cm)，取上清液微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得[8]。
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色谱柱为Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：0.1%醋酸（A）-甲醇（B），按如下条件梯度洗脱：0～15 min，95%～90%A；15～35 min，90%～70%A；35～55 min，70%～60%A；55～85 min，60%～50%A；85～95 min，10%A。每一针结束后以初始比例平衡20 min；流速1.0 ml/min，检测波长：2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁为320 nm，槲皮苷和木犀草苷均为256 nm；柱温30 ℃，进样量10 μl。在上述条件下，芦丁、槲皮苷、木犀草苷和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷分离度均大于1.5；理论塔板数均不低于3 000，见图1。
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精密吸取槲皮苷对照品储备液0.2、0.6、1.5、3.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，配制成20、60、150、300 μg/ml对照品溶液。再对上述20 μg/ml对照品溶液进行对半稀释，获得10 μg/ml对照品溶液。最终获得10～300 μg/ml浓度梯度的槲皮苷对照品溶液。分别精密吸取木犀草苷和芦丁对照品储备液0.1、0.5、1.5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，配制成10、50、150 μg/ml对照品溶液，再依次对上述对照品溶液进行对半稀释，获得5、25、75 μg/ml对照品溶液。最终分别获得5～150 μg/ml浓度梯度的木犀草苷和芦丁对照品溶液。精密吸取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品储备液0.2、1.5、3.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，配制成40、300、600 μg/ml对照品溶液。再对上述对照品溶液进行对半稀释，获得20、150、300 μg/ml对照品溶液。最终获得20～600 μg/ml浓度梯度的2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μl，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以峰面积值(Y)为纵坐标，对照品浓度(X，μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，经直线回归得线性方程，结果见表1。结果表明，4组分在一定浓度范围内呈良好线性关系，该法满足定量检测要求。
组分 方程 r 浓度范围（μg/ml） 槲皮苷 Y=1.83×103X+162.82 0.9993 10～300 木犀草苷 Y=2.35×103X-189.43 0.9989 5～150 芦丁 Y=1.72×103X +53.71 0.9992 5～150 2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 Y=4.55×103X +1902.31 0.9997 20～600 -
精密量取混合对照品溶液2 ml，加甲醇稀释至10 ml，摇匀，按“2.2”项下色谱条件重复进样5次，记录峰面积。结果表明，4种组分峰面积RSD<3%（n=5），表明精密度良好。
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取同一批（批号：200309）样品6份，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下方法测定4种组分含量，结果槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量值分别为：106.34、43.66、24.68和427.12 μg/ml，4种组分含量RSD分别1.2%，1.5%，1.6%，1.7%（n=6），表明重现性较好。
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取同一供试品溶液（批号：200309），每隔4 h按“2.2”项下方法，分别于0、4、8、12、16、20、24 h测定4种组分的峰面积值。结果槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面积分别为196142、96161、37893、1923385，RSD分别为0.8%，0.9%，1.2%，1.0%（n=7），供试品溶液在24 h内稳定。
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精密量取已知含量的养血安神糖浆（批号：200309，槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量为：106.34、43.66、24.68和427.12 μg/ml)1 ml，平行量取6份，分别精密加入“2.1.1”项下槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品稀释液液各0.5、0.2、0.1、1.0 ml，按“-2.1.2”项下方法制备，进样前用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，按“2.2”项下方法测定，每组测6次，结果平均加样回收率分别为（96.75±1.41）%、（99.61±1.01）%、（97.18±1.96）%、（99.12±0.97）%，n = 6，表明方法准确度良好。
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按上述方法测定4批养血安神糖浆含量，每批平行测定3次，结果见表2。
批号 槲皮苷 RSD（%） 木犀草苷 RSD（%） 芦丁 RSD（%） 2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 RSD（%） 191008 96.90 1.71 43.19 2.29 23.19 2.73 430.01 1.12 94.67 44.07 22.98 422.76 97.88 45.21 24.18 421.03 191211 107.13 2.84 40.86 1.44 23.52 2.77 427.65 0.69 102.34 41.34 22.26 422.11 101.76 42.05 23.57 423.16 200422 104.16 2.29 41.93 2.66 24.53 2.06 425.06 0.96 99.82 40.18 23.84 428.17 100.55 42.22 23.57 433.26 200519 101.33 1.36 40.54 1.92 20.19 2.54 422.18 0.79 98.64 41.62 21.91 425.86 99.71 42.10 20.85 419.13
2.1. 溶液的制备
2.1.1. 对照品溶液
2.1.2. 供试品溶液
2.2. 色谱条件[9-10]
2.3. 线性关系考察
2.4. 精密度试验
2.5. 重复性试验
2.6. 稳定性试验
2.7. 加样回收率试验
2.8. 样品含量测定
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本实验所测的4组分极性差异较大，选择流动相时，先后考察0.1%醋酸-甲醇、0.1%醋酸-乙腈、0.1%磷酸盐-甲醇和0.1%磷酸盐-乙腈溶液系统梯度洗脱，结果发现，以0.1%醋酸-甲醇作为流动相时，体系的基线平稳，峰型及分离度均显著优于其他体系，4组分色谱峰分离完全。
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根据槲皮苷、木犀草苷、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在双波长256 nm、320 nm下测得的色谱峰显示，分离度、色谱峰正态分布及峰面积都具有一致性，因此，根据色谱峰特征选择波长毫无争议。但是，在256 nm波长下，芦丁测得的峰面积是320 nm波长下峰面积的2倍，而320 nm波长下的峰分离度为3.4，256 nm波长下的峰分离度为1.8。从供试品图谱观察，在320 nm下峰形对称性较好。综上因素考量，本实验将芦丁的检测波长定为320 nm。
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同时考察了以50%甲醇、100%甲醇、50%乙醇、95%乙醇超声提取供试品，综合比较各组分的含量，最终选择100%甲醇超声提取的方法处理供试品。
综上所述，本实验建立了以高效液相双波长法同时测定槲皮苷、木犀草苷、芦丁和2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷4组分含量的方法，操作简单，结果准确，可用于养血安神糖浆的质量控制，亦为下一步对养血安神糖浆的工艺改进研究打下了基础。
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