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真菌性皮肤病,是指由病原菌真菌所引起的一大类感染性皮肤疾病[1],其中,浅部真菌感染性皮肤病中,足癣最为常见且发病率最高,而趾间糜烂型和水疱型为最主要的发病类型[2],患者抓痒造成皮损继发细菌感染,此时感染已不仅仅累及皮肤角质层,而是进入真皮层,甚至透过皮下组织,危害深层组织,甚至导致出现发热等全身症状。驻闽部队官兵长期穿着不透气的作战靴、胶鞋,皮肤真菌感染率普遍较高,且部队官兵训练任务重、居住环境艰苦,往往因诊疗不及时等原因,容易出现继发感染[3-4]。复方特比萘芬是在课题组前期研制的复方酮康唑软膏基础上,选择抗真菌药盐酸特比萘芬和糖皮质激素药糠酸莫米松,联合适宜的抗菌药物莫匹罗星,作为处方的主药[5]。解决了酮康唑不稳定、易变色的问题,既可利用协同作用增强治疗效果,又方便应用,提高了患者使用的依从性,改善了市售产品的有效性和安全性,具有较高的军事利用价值。本实验主要研究在制剂过程考虑加入渗透促进剂,增加药物透皮吸收速率和浓度,达到根治此类疾病、杜绝反复发作的目的。
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色谱柱为ZORBAX SB-C8柱(250 mm×4.6 mm,5 µm),流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(70∶30),检测波长248 nm,流速1.0 ml/min,柱温30 ℃,进样量10 µl。
经专属性考察发现,盐酸特比萘芬、莫匹罗星、糠酸莫米松分离度良好,所用辅料均不会对药物的测定产生干扰。以药物峰面积A为纵坐标,药物浓度C为横坐标作线性回归曲线。实验结果表明,盐酸特比萘芬线性回归方程为:A=1.763×10C+36.63,r=0.999 7,在20~200 µg/ml浓度范围内线性关系良好;莫匹罗星线性回归方程为:A=2.307C+6.777,r=0.999 8,在40~400 µg/ml浓度范围内线性关系良好;糠酸莫米松线性回归方程为:A=2.854×10C+1.763,r=0.999 8,在2~20 µg/ml浓度范围内线性关系良好。对日内、日间精密度及方法的重复性进行考察,其RSD值均小于1%;低、中、高3个水平浓度的平均回收率在98%~101%范围内,且RSD值小于1%;供试品溶液在24 h内稳定,且RSD值小于1%。以上数据表明,实验精密度、重复性、回收率、稳定性均符合要求。
制备复方特比萘酚软膏3批,每批3份,测定药物含量。实验结果表明,供试品中的3种主药莫匹罗星、糠酸莫米松和盐酸特比萘芬的含量均为标示量的90.0%~110.0%,符合规定。
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试验装置为立式Franz扩散池[6-9],药物透皮扩散试验仪,透皮有效扩散面积是3.14 cm2,接受室体积为7.8 ml。
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断颈处死SD大鼠后,用电剪刀剪除腹部的鼠毛,硫化钠溶液去除绒毛,取腹部处皮肤,将皮下脂肪与筋膜剥离,用0.9%的氯化钠注射液清洗干净后,放于冰箱4 ℃保存,备用。
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通常体外经皮渗透试验的接受液选择0.9%氯化钠注射液,但是由于复方特比萘芬软膏中3种主药在水中的溶解度不佳,为了保持其漏槽条件,考察3种主药在不同比例的聚乙二醇400-生理盐水混合液中的溶解情况。实验结果表明,3种主药在60%聚乙二醇400-40%生理盐水中都可以保持漏槽条件并达到最大溶解度,因此,实验的接受液选择60%聚乙二醇400-40%生理盐水。
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将“2.2.2”项下经过处理的大鼠皮在水平扩散池的两个半池之间固定,加接收液7.8 ml于接受池中,扩散池在(32±1)℃的水浴中预平衡1 h后,分别加入0.5 g不同浓度和种类促进渗透剂的复方特比萘芬软膏于供体池中,于0.5、1、2、4、6、8、24 h分别取样2 ml,过0.22 µm微孔滤膜后注入HPLC仪分析测定。同时,在受体池中补加等量空白接收液。以累积渗透量为指标筛选最适宜的透皮促进剂及其用量。
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累积渗透量的计算公式:
式中,Cn是在第n个取样点时所测得的药物浓度;V0是接受室的体积;Ci是在第i个取样点时所测得的药物浓度;V是取样体积;A是渗透面积(cm2)。
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取未加渗透促进剂的复方特比萘芬软膏进行体外经皮渗透性试验,计算累积渗透量。实验结果表明,不加渗透促进剂时,复方特比萘芬软膏中盐酸特比萘芬24 h的累积渗透量为8.64 µg/cm2,莫匹罗星24 h的累积渗透量为9.12 µg/cm2,而糠酸莫米松无渗透。
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在复方特比萘芬软膏中分别加入1%、3%、5%氮酮,进行体外经皮渗透性试验。以累积渗透量为纵坐标,渗透时间为横坐标,绘制累积渗透曲线。实验结果表明,以氮酮为渗透促进剂时,不同浓度氮酮对盐酸特比萘芬作用大小为3%>1%>5%,不同浓度氮酮对莫匹罗星作用大小为3%>1%>5%,不同浓度氮酮对糠酸莫米松无渗透作用。结果见表1、表2和图1、图2。
渗透时间(t/h) 氮酮溶液(%) 1 3 5 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 3.42 4.72 1.11 6 7.97 9.19 3.25 8 14.19 15.64 5.47 24 18.50 23.65 7.17 渗透时间(t/h) 氮酮溶液(%) 1 3 5 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 10.38 18.22 7.01 24 31.67 37.29 19.08 -
在复方特比萘芬软膏中分别加入5%、10%、15%丙二醇,进行体外经皮渗透性试验。以渗透时间为横坐标,累积渗透量为纵坐标,绘制累积渗透曲线。实验结果表明,10%丙二醇对复方特比萘芬软膏的促渗作用明显大于15%丙二醇,且10%丙二醇渗透量又大于3%氮酮,故本实验选择10%丙二醇作为渗透促进剂。结果见表3~5和图3~5。
渗透时间(t/h) 丙二醇溶液(%) 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 1.69 3.84 1.30 6 4.69 12.57 3.63 8 8.37 21.58 6.71 24 9.67 31.05 9.76 渗透时间(t/h) 丙二醇溶液(%) 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 3.04 4.63 5.84 6 5.92 10.29 11.57 8 11.18 15.58 19.03 24 22.44 31.41 31.73 渗透时间(t/h) 丙二醇溶液(%) 5 10 15 0.5 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 3.59 4.15 8 0 5.35 6.24 24 4.02 9.73 10.64