-
红景天为景天科大花红景天[Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms.)H. Ohba]的干燥根和根茎[1],是一种多年生草本或亚灌木植物。大部分生长于海拔3 500~5 000 m的石灰岩、花岗岩地冰川、山梁草地或山谷岩石上,享有“高原人参”、“雪山仙草”之美称,被当代医学界誉为“东方神草”,被全球医药界喻为“黄金植物”[2],己被前苏联科学家确定为植物适应原[3]。目前的研究表明,红景天具有抗应激、抗疲劳、抗氧化、抗癌、抗抑郁、保护肝肾、增强机体免疫力和神经保护等作用[4-7]。
目前,国内外对红景天多集中于其药效研究,体内药物含量测定和生物利用度研究又多以大鼠为研究对象。在以往研究的大鼠试验中,不同给药途径和不同剂量下,红景天苷绝对生物利用度(Fabs)结果为32.1%~98%[8-11],范围之大可能和红景天苷在体内的主动转运有关。而主要参与分子主动转运的钠依赖性葡萄糖转运体介导(SGLT1)在肠黏膜中所占的比例极其有限。在有限的肠道转运介导下,剂量不同可能会导致生物利用度研究结果不同。当口服红景天苷剂量大于24 mg/kg时,大鼠肠道出现了饱和吸收过程,且证明此饱和过程与SGLT1相关[12]。由于肠道中SGLT1占比有限,若给药剂量过高,可能会导致药物肠道重吸收较差,进而体现为生物利用度降低。因此,为了更加科学地考察体内生物利用度,合适剂量的选择尤为重要。
关于测定比格犬体内红景天苷含量的分析方法研究报道较少。Mao等[8]建立了测定犬血浆中红景天苷含量的HPLC法,线性范围为0.83~520 μg/ml(r=0.992 6),最低定量下限为0.83 μg/ml。因定量限较高,不足以满足其体内药动学分析。陈帅等[13]应用UHPLC-MS/MS法,采用柱前衍生化的样品处理同时测定了比格犬血浆中的红景天苷和酪醇含量。其中,红景天苷的定量下限为0.02 μmol/L,质量浓度相当于6.01 ng/ml。该方法的样品处理方式为先用乙腈蛋白沉淀法去除基质中的蛋白组分,上清溶液经碱化后孵育进行衍生化,最后用甲基叔丁基醚进行液液萃取,氮气吹干复溶后进样。虽检测限满足体内药动学分析,在批量处理样品时条件苛刻且步骤复杂。且以上研究均未对红景天苷在比格犬体内绝对生物利用度进行评估。
本实验旨在建立准确、快速、灵敏的LC-MS/MS法测定比格犬血浆中红景天苷含量,并对其绝对生物利用度进行研究。血浆样品预处理采用蛋白沉淀,并将验证后的方法应用于临床前药动学研究,包括生物利用度研究,为支持临床药动学试验设计提供依据。
HTML
-
分别取6个不同来源的比格犬空白血浆样品以及用相应比格犬空白血浆配制的定量下限(LLOQ)样品进行LC-MS/MS分析测定,考察不同来源空白血浆中的内源性物质是否干扰待测物及内标的测定。
结果表明,比格犬空白血浆中的内源性物质不干扰红景天苷的测定,同时内标不干扰待测物的测定,待测物对内标也无影响。
-
在选定的条件下,红景天苷和内标峰形良好,红景天苷的保留时间约为1.6 min,内标的保留时间约为1.2 min,内源性杂质不干扰测定。空白血浆、红景天苷及内标、红景天苷及内标加入空白血浆中的色谱图、比格犬口服1.5 h样品中红景天苷及内标色谱图见图1。
-
取“1.4”项下制备的标准含药血浆样品50 μl,按照“1.5”项下血浆样品前处理方法操作,以每个待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,采用加权(W= 1/X2)最小二乘法进行回归运算,求得的直线回归方程即为标准曲线,相关系数r均>0.998 6。比格犬血浆样品中红景天苷浓度在10~1 0000 ng/ml与峰面积比线性良好,最低定量浓度为10 ng/ml。典型标准曲线方程为:Y = 0.003 48X+0.000 397(r=0.999 1)。
-
取比格犬LLOQ血浆样品(红景天苷质量浓度为10 ng/ml)进行6份样本分析,连续测定3 d并分别根据当日标准曲线求得每份样本的测得浓度。求得该质量浓度红景天苷的日内精密度分别为8.3%,日间精密度为7.3%,准确度(RE)为6.0%。实验结果表明,LC-MS/MS法测定比格犬血浆中红景天苷的定量下限为10 ng/ml。
-
取比格犬低、中、高3个浓度质控样品,按照“1.5”项下操作,每个浓度进行6样本分析并在连续3 d内测试,分别根据当日标准曲线计算每份样本的测得浓度并根据QC样品结果计算本方法日内、日间精密度和准确度。
红景天苷质控(QC)样品的精密度与准确度结果见表1。待测物低、中、高质控样品的日内和日间精密度和准确度均符合生物样品测定相关要求。待测物低、中、高质控样品的日内和日间精密度和准确度均符合生物样品测定相关要求。
浓度(ng/ml) 日内(n=6) 日间(n=18) 准确度(RE/%) 精密度(RSD/%) 准确度(RE/%) 精密度(RSD/%) 10 8.3 10.0 7.3 6.0 30 9.7 −2.0 6.0 −1.3 500 3.3 −3.0 3.4 −0.2 8 000 3.8 −3.5 2.7 −1.5 -
分别取6个不同来源比格犬空白血浆和一份空白溶血血浆50 μl,不加内标溶液(用50 μl 40%乙腈替代内标工作溶液),按照“1.5”项下操作,40 ℃氮气下吹干,加入200 μl由流动相配制的相对应的低、高浓度对照质控溶液和内标溶液,涡流后离心5 min,取2 μl进行LC-MS/MS分析,获得相应峰面积(A)。同时,另取去离子水50 μl代替比格犬空白血浆,按上述方法操作获得相应峰面积(B)。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算基质效应,公式为A/B×100%,并以分析物和内标的基质效应比值计算内标归一化的常规基质效应和溶血血浆基质效应。
在比格犬常规血浆样品中,红景天苷低、高浓度经内标校正后的基质效应分别为96.3%和96.6%,相对标准差分别为8.4%和4.1%。溶血血浆样品中,低、高浓度经内标校正后的基质效应分别为99.4%和96.7%,相对标准差分别为5.0%和7.0%。
结果表明,待测物红景天苷在本试验选择的色谱和质谱条件下,可忽略基质效应的影响。
-
采用比格犬空白血浆配制的低、中、高3个浓度的血浆样品,按照“1.5”项下操作,每个浓度进行6样本分析。同时另取比格犬空白血浆50 μl,不加内标溶液(用50 μl 40%乙腈溶液替代内标工作溶液),其余按照“1.5”项下操作,于40 ℃氮气下吹干后,加入对应的低、中、高浓度对照质控溶液和内标溶液,涡流5 min,取2 μl进行分析,获得相应峰面积(n=3)。用提取后色谱峰面积与未经提取的色谱峰面积之比计算提取回收率。
比格犬血浆样品经蛋白沉淀处理后,红景天苷在低、中、高浓度的回收率分别为91.8%、94.3%和89.5%。
-
考察了红景天苷储备液和工作溶液室温6 h、比格犬血浆样品室温放置24 h、比格犬血浆样品−20 ℃/−70 ℃经历5次冷冻−解冻循环的稳定性以及比格犬血浆样品−20 ℃/−70 ℃经历22 d冷冻后的稳定性。全血样品室温/湿冰放置2 h、样品处理后自动进样器放置96 h。
结果表明,红景天苷储备液和工作溶液室温至少6 h、血浆样品中在室温放置24 h、−20 ℃/−70 ℃冻存22 d、在−20 ℃/−70 ℃存放条件下反复室温冻融5次,以及样品处理后,在自动进样器放置96 h,红景天苷能够保持良好的稳定性。自全血采集至分离待测血浆样本的室温/湿冰2 h内,红景天苷在全血中保持稳定。
-
本实验考察了血浆浓度超出定量上限的比格犬血浆样品,经空白比格犬血浆稀释后的准确度。取红景天苷的稀释质控样品(比格犬血浆样品红景天苷质量浓度为80 000 ng/ml),用空白比格犬血浆稀释20倍后,按“1.5”项下操作,进行6份样本分析。结果表明,比格犬血浆样品经空白比格犬血浆稀释20倍后测定不影响结果的准确度。
-
比格犬单剂量口服给药红景天苷15 mg/kg或静脉注射红景天苷1.5 mg/kg后,按“1.6”项下采集的各时间点血浆样品,并按照“1.5”项下操作,进行LC-MS/MS分析,测定红景天苷的比格犬血浆浓度。口服给药红景天苷15 mg/kg和静脉注射红景天苷1.5 mg/kg后的血药浓度-时间数据曲线分别见图2和图3。采用WinNonlin软件以非房室模型计算药动学参数(表2、表3)。
参数 雄性犬 雌性犬 平均值 AUC0−t(ng·h/ml) 15 976±1 702 25 095±1 527 20 535±5 200 AUC0−∞(ng·h/ml) 16 005±1 703 25 211±1 692 20 608±5 266 MRT0−∞(t/h) 2.20±0.561 2.39±0.055 2.29±0.371 t1/2z(t/h) 1.02±0.108 1.61±0.845 1.31±0.628 CLz(L/h·kg) 0.945±0.105 0.597±0.039 0.771±0.203 Vz(L/kg) 1.39±0.232 1.35±0.613 1.37±0.415 cmax(ng/ml) 7 867±2 978 11 493±3 995 9 680±3 725 F(%) 34.2±4.9 55.2±7.4 43.9±11.2 参数 雄性犬 雌性犬 平均值 AUC0-t(ng·h/ml) 4 735±1 050 4 557±415 4 646±721 AUC0-∞(ng·h/ml) 4 781±1 042 4 602±411 4 691±715 MRT0-∞(t/h) 1.010±0.064 1.030±0.048 1.020±0.052 t1/2z(t/h) 0.933±0.028 1.03±0.174 0.980±0.132 CLz(L/h·kg) 0.325±0.078 0.328±0.028 0.326±0.052 Vz(L/kg) 0.437±0.104 0.487±0.102 0.462±0.096 cmax(ng/ml) 9 000±1 526 9 620±2 037 9 310±1 645 本试验以比格犬单剂量静注给药红景天苷1.5 mg/kg后体内血药浓度-时间曲线下面积AUC0−∞为参比,计算比格犬单次口服给药红景天苷入血的绝对生物利用度。考虑到比格犬动物实验个体差异的特殊性,采用6条比格犬(雌雄各半)单剂量口服给药红景天苷15 mg/kg及6条比格犬(雌雄各半)单剂量静注给药红景天苷1.5 mg/kg后,血浆AUC0-∞的平均值进行比较,得到红景天苷在比格犬体内的绝对生物利用度为(43.9±11.2)%。