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前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球范围内第二位最常见的男性癌症,也是全球第二大致死癌症[1]。据统计,我国前列腺癌的发病率呈逐年上升的趋势,其中,上海地区该病的发病率和病死率较高,但总体而言,亚洲国家前列腺癌的发病率明显低于西方国家[1-3]。在前列腺癌的治疗中,局限性前列腺癌常规行根治性前列腺切除术或放射治疗,而对于进展期患者则需要接受内分泌治疗即雄激素阻断治疗(androgen deprivation therapy,ADT)。虽然ADT在早期可以明显抑制激素依赖性前列腺癌的进展,但是随着治疗时间的延长,激素依赖性前列腺癌会逐渐失去对ADT的反应而转化成为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC),目前对CRPC尚无有效的治疗方法。因此,亟需深入挖掘CRPC病程进展中的关键基因和蛋白,为CRPC提供潜在治疗靶标。
Abula等[4]进行了PCa蛋白质组学文献的数据挖掘,发现了前列腺肿瘤组织和正常组织中41种差异表达蛋白,并构建了蛋白相互作用网络。其中,3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶β亚基(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase β subunit,MCCB)就是其中的重要差异蛋白之一。MCCB是生物素依赖性羧化酶(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase,MCC)的两个组成亚基之一,由563个氨基酸组成[5-8],MCCC2是该蛋白的编码基因。已有研究报道,MCCC2是一种致癌基因,与包括肝细胞癌、结直肠癌以及乳腺癌在内的多种肿瘤的形成和发展密切相关[9-11],有望成为肿瘤治疗干预的潜在靶标。
在本研究中,我们主要探讨了MCCC2与前列腺癌的关系。首先,采用慢病毒与质粒构建了稳定低表达MCCC2的DU145细胞株并通过Western blot和qPCR分析敲减率;然后,系统考察敲减MCCC2对DU145前列腺癌细胞的增殖、迁移以及凋亡的影响,明确下调MCCC2与DU145细胞系肿瘤生物学特性的改变的相关性。
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DU145细胞复苏后接种于含10%灭活的胎牛血清,100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养液中,置于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中生长,每隔3 d传代一次。将shRNA质粒复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养皿。细胞在CO2培养箱中37 ℃孵育24 ~ 48 h进行转染;再用嘌呤霉素筛选低表达MCCC2-DU145的稳定细胞株。
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将复苏的细胞接种于大的培养皿中。3 d后细胞以3×103个/孔,接种于96孔板。分别在0、24、48、72、96 h后,加CCK-8试剂,在450 nm处测定A值,根据A值分析结果。
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取出DU145细胞、NC-DU145细胞以及shMCCC2-DU145细胞,弃掉上清,加入PBS缓冲液洗3次,每次1 ml;加入细胞裂解液(Western及IP细胞裂解液∶PMSF = 100∶1),吹打细胞,置冰上裂解20 min;收集细胞裂解液于1.5 ml的EP管中,4 ℃,12000 r/min,离心15 min;上清液即为提取的细胞总蛋白溶液,可用于BCA法定量;加入5 ×蛋白加样缓冲液,沸水中煮5 min,于−20 ℃保存,可用于后续的Western blot实验。
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配胶,捡漏,加入样品,先将电压调为80 V,待marker条带分离后,将电压调制120 V,直到蛋白样品跑至凝胶底部,停止电泳;恒流250 mA,冰浴90 min的条件下转膜;染色,封闭,再孵育MCCC2抗体以及二抗,置于Tanon5200光密度扫描仪中进行拍照;用Image J 灰度分析差异性蛋白条带。
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将复苏的细胞接种于培养皿中,待对数生长期时,细胞以5 × 105个/孔接种于6孔板中,在37 ℃,5% CO2的恒温培养箱中孵育;48 h后,将培养基吸掉,加入PBS洗涤3次,每次1 ml;加入RA2裂解液,每孔500 μl,置于冰上1 min;将裂解液收集于内套管中,在12000 r/min下离心1 min;取出,将外套管中的液体倒去,向内套管中加入500 μl洗液,在12000 r/min下离心1 min;重复上述步骤一次;重复上述步骤,但是这次不加洗液,在12000 r/min下离心1 min;取出,弃去外套管,将内套管移入新的1.5 ml Ep管中,加入30 μl的洗脱液,室温静置2 min,在12000 r/min下离心1 min;得到总的RNA,并测定其浓度。
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按照1 000 μg逆转录,总反应体系为20 μl。反应条件为:37 ℃,15 min;85 ℃,30 s;4 ℃,永恒。反应体系见表1。
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反应条件:94 ℃预变性30 s后94 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共进行40个循环后,进行溶解曲线的检测。反应体系见表2。
物质 加入量(V/μl) 总RNA X(X=1000/c,c为上述测定的总RNA的浓度) Rnase Free dH2O 16-X 5×Mix 4 物质 加入量(V/μl) cDNA 1.0 Primer R 0.3 Primer F 0.3 ddH2O 3.4 SYBR 5.0 总计 10 -
进行Transwell实验以评估细胞在体外的迁移能力。细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤2次,用胰蛋白酶消化,稀释为每毫升含1 × 106个细胞,在Transwell室中,加入200 μl含1% FBS培养基的细胞液,下层用600 μl含10% FBS培养基处理。置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养48 h,然后用棉签小心地擦去未穿过小孔的细胞,再用4%多聚甲醛固定30 min,最后用结晶紫染色1 h。使用倒置显微镜拍摄细胞照片,Image-Pro Plus 6.0分析实验结果。
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将细胞以5 × 105/孔的比例接种于6孔板中,37 ℃孵育48 h。使用Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒,按照说明书操作方法,使用流式细胞术检测细胞凋亡。
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数据分析通过SPSS (21.0)统计软件进行,采用单因素方差分析,实验结果用(
$\bar x$ ± s)表示。与对照组比较,P < 0.05,则认为差异具有统计学意义。