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临床流行病学显示,终末期肾脏病患者发生房颤的风险是一般人群的10倍[1]。口服抗凝剂是预防房颤血栓形成的重要治疗方法,但现有口服抗凝剂缺乏针对终末期肾脏病患者的临床研究,其安全性和有效性并不确切[2-3]。阿哌沙班是一种新型口服Xa因子的抑制剂,广泛应用于预防和治疗血栓形成。研究显示,阿哌沙班可降低肾病合并房颤患者的大出血、血栓栓塞和死亡风险,为此类患者提供新的抗凝药物选择[3]。但阿哌沙班缺少在终末期肾脏病患者(血肌酐清除率<15 ml/min)中使用的临床资料,且目前阿哌沙班肠道吸收部位尚不明确,其吸收的影响因素也不清楚,因而,一定程度上限制了其应用。本实验拟通过探究阿哌沙班在肾衰大鼠肠道内的吸收部位、吸收机制以及P糖蛋白抑制剂对其肠道吸收的影响,以便为阿哌沙班在终末期肾脏病患者中使用提供一定的参考依据。
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精确称取NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、MgCl2·6H2O 0.02 g、NaH2P04 0.32 g、NaHCO3 1.37 g,用超纯水溶解后加入0.37 g CaCl2 至溶解完全,临用前加入葡萄糖1.4 g,转移至1000 ml容量瓶中定容至刻度,调节pH至7.4。
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精确称取9 mg阿哌沙班原料药置于容量瓶中,加入3 % SDS,定容至100ml,作为阿哌沙班储备液备用。
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分别取0.5、1.0、4.0ml阿哌沙班储备液至100 ml容量瓶中,加入K-R营养液,超声溶解后定容至100ml,配置成的阿哌沙班溶液浓度分别为0.45、0.90、3.60 μg/ml。
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精确称取0.5g的盐酸维拉帕米置于100 ml容量瓶中,加入超纯水溶解配制成浓度为5 mg/ml的盐酸维拉帕米储备溶液。分别取1 ml盐酸维拉帕米储备溶液和1 ml阿哌沙班储备溶液置100ml容量瓶,配制成含盐酸维拉帕米浓度为50 μg/ml、阿哌沙班浓度为0.9 μg/ml的供试品溶液。
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色谱柱:Gemini 5u C18 110A色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:A相为甲醇,B相为10 mmol/L醋酸胺溶液;柱温:30 ℃;流速:1.0 ml/min;进样量:10 μl。
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分别取空白K-R溶液、阿哌沙班K-R溶液以及阿哌沙班K-R回流收集液,2000 r/min离心5 min后取上清液10 μl,按照“2.2.1”项下色谱条件进样分析[4-5]。结果见图1。实验结果表明,肠灌流液中阿哌沙班峰形良好,保留时间约为7 min,空白K-R溶液及空白肠灌流液对其无干扰,专属性良好。
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精密量取阿哌沙班标准储备液用K-R溶液配制系列标准溶液,各取1 ml加入0.5 ml甲醇,离心后取上清液,按照“2.2.1”项下方法进样分析。线性回归分析结果表明阿哌沙班在0.36-4.5 µg/ml范围内线性关系良好。
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精密量取阿哌沙班标准储备液用K-R溶液配制浓度呈0.45、0.9、3.6 μg/ml的阿哌沙班供试品溶液,各取1 ml加入0.5 ml甲醇,离心后取上清液,按照“2.2.1”项下方法进样分析,计算阿哌沙班在低、中、高浓度溶液中的回收率。低、中、高浓度溶液中阿哌沙班平均回收率分别为97.39 %、98.91 %、99.92 %,RSD分别为1.94 %、1.88 %、1.25 %,结果表明本方法准确度良好。
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精密量取阿哌沙班标准储备液用K-R溶液配制浓度为0.45、0.9、3.6μg/ml的阿哌沙班供试品溶液,置于37 ℃水浴3 h,考察药物在K-R液中的稳定性。结果0.45、0.9、3.6 µg/ml的阿哌沙班供试液的 RSD 分别为 0.51 %、1.65 %、0.50%,表明3 h内阿哌沙班的稳定性良好。
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雄性SD大鼠适应性饲养1周后按剂量40 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠,待麻醉成功后,取仰卧位固定,常规消毒,沿左腹旁肾脏位置切开皮肤并逐层分离皮下组织进入腹腔,暴露左侧肾脏,切开上、下极的包膜,采用针形电烧灼器分别在左肾上、下极电凝肾脏表面,逐层缝合肌层和皮肤,关闭腹腔。2周后,沿右腹旁肾脏位置处切口切开皮肤,逐层分离皮下组织进入腹腔,暴露右侧肾脏,用丝线结扎右肾肾门,切除右肾。
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取慢性肾功能衰竭大鼠,禁食12 h,期间自由饮水,按剂量40 mg/kg 腹腔注射1%戊巴比妥钠,待麻醉成功后,取仰卧位固定,常规消毒皮肤。沿腹中线取长约3 cm纵行手术切口,分别在十二指肠、空肠、回肠、结肠处各取间距约为10 cm两个微小切口,分别在两切口处置入无菌引流管,并用丝线固定。取预热至37 ℃的生理盐水冲洗肠道内容物,直至澄清液体,引流管连接恒流泵,以2.0 ml/min的起始流速将浓度为0.9 μg/ml的阿哌沙班溶液泵入肠段,待肠段内药液充满后将流速降低至0.2 ml/min,此后按15 min/次的频率收集肠回流液,计算肠回流液的质量减少量及15 min内收集到的流出液体的质量,并测定收集液中药物浓度。实验持续时间2 h。样品采集完后处死大鼠,剪下所研究的肠段,将其平铺,测量其长度以及横截面半径。
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采用质量法对回流液流入和流出体积进行校正。按下式计算吸收速率常数(Ka)和表观渗透系数(Papp):
式中Vin和Vout分别为灌入和收集的回流液体积(ml),Cin、Cout分别为进口和出口处回流液中药物的质量浓度(μg/ml),v为灌流速度(ml/min),r为被灌流肠段的横截面半径(cm),L为被灌流肠段的长度(cm)。
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根据测定收集液中阿哌沙班浓度,计算不同肠段中阿哌沙班Ka和Papp,结果发现空肠对阿哌沙班的吸收速率最快,结肠段最慢,结果具有统计学意义。各肠段间的阿哌沙班表观吸收系数未见明显异常。如表1所示。
肠段 Ka×10−2/min Papp×10−4(cm/s) 十二指肠 1.43±0.18# 0.17±0.6 空肠 1.80±0.27*# 0.24±0.03 回肠 1.35±0.24# 0.16±0.03 结肠 0.87±0.18 0.14±0.05 注: #P<0.05,与结肠比较;*P<0.05,与回肠比较 -
配制浓度分别为0.45、0.9、3.6 μg/ml的阿哌沙班灌流液,按“2.3.2”项下操作流程选取肾衰大鼠回肠进行灌流,测定灌流液中阿哌沙班的浓度,计算药物Ka和Papp。结果显示,在回肠段,阿哌沙班药物浓度越高,肠道对其吸收速率和表观吸收系数越低(P<0.05),如表2所示。
浓度(μg/ml) Ka×10−2/min Papp×10−4(cm/s) 0.45 1.67±0.38# 0.27±0.05# 0.90 1.35±0.24 0.16±0.03 3.60 0.81±0.18 0.13±0.03 注: #P<0.05,与高浓度组比较 -
按“2.1.4”项下方法配制含盐酸维拉帕米的阿哌沙班灌流液,按“2.3.2”项下操作流程选取大鼠空肠及回肠进行灌流,测定灌流液中阿哌沙班的浓度,计算药物Ka和Papp,研究P-gp 外排作用对阿哌沙班在空肠和回肠段的吸收特性影响。结果显示,加入维拉帕米后,阿哌沙班的Ka和Papp的值均增加,提示阿哌沙班是 P-gp 的底物,P-gp抑制剂显著促进阿哌沙班的肠吸收,如表3所示。
药物组别 空肠 回肠 Ka×10−2
/minPapp×10−4
(cm/s)Ka×10−2
/minPapp×10−4
(cm/s)阿哌沙班 1.80±0.27 0.24±0.03 1.35±0.24 0.16±0.03 阿哌沙班+维拉帕米 2.97±0.44# 0.53±0.12# 1.89±0.51* 0.31±0.04 注: # P<0.05,空肠段与阿哌沙班单药组比较;*P<0.05,回肠段与阿哌沙班单药组比较
Study on intestinal absorption characteristics of apixaban by in vivo one-way perfusion in rats with renal failure
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202112012
- Received Date: 2021-12-06
- Rev Recd Date: 2022-06-29
- Available Online: 2022-11-28
- Publish Date: 2022-11-25
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Key words:
- apixaban /
- renal failure /
- one-way perfusion /
- intestinal absorption characteristics
Abstract:
Citation: | ZHANG Huan, WANG Li, ZHANG You, XIE Pei, LI Na, DING Jiarong, WANG Lei. Study on intestinal absorption characteristics of apixaban by in vivo one-way perfusion in rats with renal failure[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(6): 515-518, 531. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202112012 |