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山莨菪碱是托品酸和有机碱形成的酯类,结构与阿托品和东莨菪碱相类似,在托品基的6位碳原子上有不对称的羟基,是一种天然的莨菪烷类生物碱[1-3]。山莨菪碱属于非选择性的毒蕈碱受体阻断剂,能够阻断M1和M5受体亚型。因此,山莨菪碱有一系列相似于阿托品的药理作用[4],如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌、抑制胃肠蠕动及膀胱收缩,其他还包括散瞳、扩张支气管等[5],适用于胃或肠道的绞痛、急性微循环障碍及有机磷酸中毒等临床病症[4,6]。但单独使用山莨菪碱用药剂量大,故常出现口干、面红、视近物模糊、心跳加快、排尿困难等阿托品样副作用,因此极大限制了其在临床上的广泛应用。近年来,随着对山莨菪碱注射液及其衍生物药理作用的深入研究,发现其胆碱能抗炎通路对慢性炎症如风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等慢性疾病具有较好的药效作用[4]。但这些疾病的疗程较长,如何降低或消除山莨菪碱在治疗过程中的阿托品样副作用是临床现实问题。
新斯的明是胆碱酯酶抑制剂,进入机体后,通过可逆性抑制胆碱酯酶活性,使乙酰胆碱不能水解,从而提高体内受体部位的乙酰胆碱浓度,加强和延长乙酰胆碱的作用,呈现出全部胆碱能神经兴奋的效应[4]。将毒蕈碱受体阻断剂和胆碱酯酶抑制剂这两类药物以适当的比例联合使用(即复方山莨菪碱)来协同激活胆碱能抗炎通路,增强其抗炎效果并降低其副作用的治疗方案,有望为临床治疗类风湿性关节炎提供新的治疗方案[4]。
前期的研究结果显示:通过将盐酸消旋山莨菪碱与甲硫酸新斯的明组合制备而成的复方山莨菪碱注射液不仅对类风湿关节炎具有良好的抗炎效果,还可明显降低山莨菪碱的阿托品样不良反应。但目前国内外未见有关复方山莨菪碱注射液遗传毒性安全性评价方面的研究报道。为提高临床用药的安全性,本实验采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)、体外培养CHO细胞染色体畸变试验和ICR小鼠骨髓微核试验方法评价其是否具有遗传毒性,为进一步的临床研究提供科学依据。
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受试物为复方山莨菪碱注射液,两种成分的化学分子结构式详见图1和图2(无色澄明溶液,批号20101222;规格:5 ml中含盐酸消旋山莨菪碱1 g与甲硫酸新斯的明2 mg;由海军军医大学药学系提供)。溶媒对照为氯化钠注射液(无色透明液体,批号110714K2,安徽丰原药业股份有限公司)。
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组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)TA1535、TA102、 TA100、TA98和TA97 5个菌株,由复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室赠予,储存于液氮中。实验前进行菌株鉴定,均符合规定标准。CHO细胞由国家上海新药安全评价研究中心赠予。
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购自美国MOLTOX公司(批号分别为2765和2715,有效期至:2013-05-17和2012-02-12),保存于−80 ℃冰箱。
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选用60只SPF级的ICR小鼠,雌雄各半(上海市西普尔-必凯动物有限公司,合格证号2008001616722)。检疫期为3 d,每日观察动物的外观、粪便和摄食等情况并记录。自购入日起的当日和检疫结束当日共两次称量所有动物的体重(检疫结束时的体重:雌鼠21.24~23.74 g; 雄鼠21.32~23.72 g),且根据该体重将雌、雄小鼠分别按随机区组法分组,共分为6组,每组10只。
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按《药物遗传毒性研究技术指导原则》等[8-9]的设计要求,选用标准试验组合中的细菌回复突变试验 [10],体外染色体畸变试验[11]和体内微核试验[12]来全面评价复方山莨菪碱注射液的遗传毒性。
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应用组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌TA1535、TA102、TA100、TA98和TA97共5种菌株进行测试。对不受溶解度或细胞毒性限制的受试物最高浓度应达到5 mg/皿 [10],故设复方山莨菪碱注射液(以5 ml中含盐酸消旋山莨菪碱1 g与甲硫酸新斯的明2 mg为计)总剂量为0.5、5、50、500、5 000 μg/皿共5组,此外还有对照组,包括空白对照、溶媒对照和阳性对照。按标准的平板掺入法操作,细菌在有或没有S9代谢活化系统(-S9组在每个平皿的试验体系中加入0.5 ml的磷酸缓冲液,+S9组在每个平皿的试验体系中加入0.5 ml的S9混合液)的平行条件下,将相应浓度的受试物溶液、溶媒对照品(氯化钠注射液)或阳性对照品溶液分别加入到无菌的试管中(表1和表2)0.1 ml,每个组别均设3个平行。以上所有物质与顶层琼脂混匀后,迅速铺浇到底层琼脂平板上,待其凝固后倒置培养48~72 h,通过肉眼或显微镜仔细观察各剂量组的菌苔是否正常,区分受试物沉淀与白色菌落,判断是否有由受试物导致的明显抑菌现象,接着采用手工计数的方法记录每皿中全部回复突变的菌落数量,统计3个平行皿的均值和标准差,与溶媒对照组进行比较。按上述操作再验证一次。
剂量组
(μg/皿)TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 76.7±4.2 76.3±3.2 46.3±2.3 38.3±6.8 96.3±10.5 112.7±17.0 123.0±2.6 170.7±38.3 15.3±5.0 33.3±9.5 500 69.3±8.3 112.0±12.2 46.0±1.7 45.7±9.7 97.3±11.4 115.3±17.9 187.0±53.8 166.7±41.6 28.3±4.5 30.7±2.1 50.0 74.7±1.2 83.7±14.8 36.7±7.0 39.3±12.8 85.3±3.0 132.7±20.0 183.3±5.7 159.0±36.8 31.3±8.1 30.0±10.5 5.0 76.7±12.3 64.7±11.0 40.7±12.2 36.3±13.6 138.7±47.4 137.7±15.9 158.3±17.4 155.0±32.6 25.3±3.2 27.3±8.3 0.5 63.0±5.2 74.0±20.3 42.7±12.8 36.3±11.9 138.0±45.4 119.3±10.3 176.0±44.2 170.7±40.0 23.3±1.2 29.3±5.7 空白对照 90.7±29.5 78.7±2.3 35.0±4.4 41.3±8.1 119.3±14.0 125.3±9.2 201.3±21.4 192.0±20.8 27.3±6.8 28.0±3.6 溶媒对照 72.0±12.0 72.0±11.1 35.3±2.3 37.0±2.0 121.3±9.0 123.3±9.4 167.3±18.6 210.0±25.0 32.3±6.6 30.0±2.0 阳性对照 653.3±83.3 583.3±28.9 714.0±53.0 625.3±162.0 802.7±140.9 651.0±64.5 1093.3±122.2 1026.7±83.2 622.7±189.9 752.0±44.5 阳性对照品:-S9组TA97、TA98敌克松(50 μg/皿),TA100、TA102 甲基磺酸甲酯(1 μg皿);TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物(0.5 μg/皿)+S9组TA97、TA98、TA100 2-AF(10 μg/皿);TA102 1,8-二羟基蒽醌(50 μg/皿);TA1535环磷酰胺(50 μg/皿) 剂量组
(μg/皿)TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 65.0±23.4 64.7±15.7 17.0±3.5 25.7±1.5 74.3±1.0 89.0±4.4 108.3±6.6 102.7±19.2 18.3±2.1 16.0±3.5 500 73.0±6.1 69.0±12.1 22.0±6.9 20.3±2.9 82.3±24.4 97.7±7.8 162.0±45.4 169.3±31.0 20.0±4.6 19.0±5.6 50.0 74.0±26.4 78.3±7.1 20.0±6.2 24.3±7.5 82.3±29.4 88.0±8.2 188.3±4.5 157.0±37.6 22.0±5.3 20.0±3.6 5.0 60.7±16.8 58.0±8.0 24.0±3.0 21.3±3.9 92.0±45.2 89.7±10.0 162.7±51.0 161.0±35.0 22.7±9.8 21.0±3.6 0.5 56.7±8.1 68.7±11.8 21.0±6.0 19.0±1.7 104.0±31.2 97.7±7.6 143.0±56.2 157.3±41.0 20.0±2.6 24.0±2.0 空白对照 80.7±7.0 76.7±2.1 25.3±2.5 22.3±6.8 110.0±10.0 102.7±30.6 221.3±34.0 151.0±36.8 17.3±3.0 15.0±5.2 溶媒对照 85.7±7.6 84.0±7.0 24.0±5.2 21.3±3.0 111.3±21.9 92.3±7.4 169.3±18.0 155.0±32.4 30.3±9.3 23.3±5.0 阳性对照 660.0±66.8 581.0±157.0 564.0±65.8 618.7±112.1 565.3±65.2 657.3±115.7 1064.0±24.0 1044±26.2 552.0±78.0 597.0±89.3 阳性对照品:-S9组TA97、TA98敌克松(50 μg/皿),TA100、TA102 甲基磺酸甲酯(1 μg皿);TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物(0.5 μg/皿)+S9组TA97、TA98、TA100 2-AF(10 μg/皿);TA102 1,8-二羟基蒽醌(50 μg/皿);TA1535环磷酰胺(50 μg/皿) -
采用体外培养的CHO细胞在有或没有S9代谢活化系统的平行条件下进行测试。预试验最高浓度设定为5 mg/ml,再按等比级数设计若干个浓度。正式试验的最高浓度产生的细胞毒性应约为50% [11]。故根据预试验测定IC50(50 %细胞生长抑制浓度)为235.0 μg/ml,因此一共设3个剂量组,依次为58.75、117.5和235.0 μg/ml,另设阳性对照组(-S9组为0.5 μg/ ml丝裂霉素C溶液,+S9组为60 μg/ ml环磷酰胺溶液)和溶媒对照组(氯化钠注射液),每个组别均设2个平行。-S9/4 h组和+S9/4 h组:受试物作用细胞4 h后弃全部培养基,用PBS洗涤后重新添加新的10 ml 1640完全培养基,放入培养箱中继续培养至24 h后收集细胞;-S9/24 h组:受试物作用细胞24 h后收集细胞。终止培养前4 h加入20 μg/ml秋水仙碱,目的是使大部分细胞的有丝分裂停止在中期相,所有细胞依次经过0.75% KCl低渗、固定(甲醇∶冰乙酸=3∶1)、涂片和Gimsa染色处理,在显微镜下选择染色体数目完整且分散良好的中期分裂相染色体作为观察对象,观察染色体数量和结构的改变。分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型(表3),计算每组的染色体畸变率。
剂量组(μg/ml) 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细
胞数/个畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 -S9/24 h 溶媒对照组 200 0 0 2 0 0 0 0 2 1.0 58.75 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 117.5 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 235.0 200 2 0 0 0 0 0 0 2 1.0 阳性对照组 100 25 2 0 3 0 4 0 21 21.0* -S9/4 h 58.75 200 1 0 0 0 0 0 0 1 0.5 117.5 200 1 0 0 0 0 0 0 1 0.5 235.0 200 2 0 0 0 0 0 0 2 1.0 +S9/4 h 溶媒对照组 200 0 0 0 0 0 1 0 1 0.5 58.75 200 2 0 0 0 0 0 0 2 1.0 117.5 200 1 0 0 0 0 0 0 1 0.5 235.0 200 1 0 1 0 0 0 0 2 1.0 阳性对照组 100 15 1 0 1 1 8 0 20 20.0* *P<0.05,与溶媒对照组比较。 -
采取与临床拟用途径一致的给药方式[12],对ICR小鼠采用单次经尾静脉注射的给药方式。根据受试物急性毒性的试验结果:半数致死量LD50为60.4 mg/kg。本次试验的最高剂量为1/2 的LD50,最高剂量之下的其他剂量保持剂量间距为2~3倍[12]。故共设3个剂量组(分别为7.5、15.0和30.0 mg/kg),及溶媒对照组(氯化钠注射液,给药方式与受试物组相同)和阳性对照组(剂量为40 mg/kg的环磷酰胺溶液,临用时用氯化钠注射液配制成4.0 mg/ml的环磷酰胺溶液,给药方式为单次腹腔注射),给药容积均为10 ml/kg。因此,总共有六组,其中的高剂量组有两组,分别在药物作用24 h和48 h后处死,除高剂量48 h组外,其他组均在药物作用24 h后处死。取小鼠两侧大腿股骨制备骨髓涂片,每只小鼠制2张骨髓片,自然干燥后染色。所有动物均镜检约1 000个嗜多染红细胞(PCE),计数含微核的PCE数(MNPCE),统计微核发生率,在记录200个PCE的同时计数观察到的所有正染红细胞(NCE)的数量(表4),通过PCE/NCE值来评价受试物是否具有骨髓毒性。
剂量组
(mg/kg)动物数
(只)雄鼠 雌鼠 观察PCE数(个) PCE/ (PCE +NCE) 微核率($\bar x $±s, ‰) 观察PCE数(个) PCE/(PCE +NCE) 微核率($\bar x $±s, ‰) 溶媒对照组 5 10 125 1.00±0.15 0.40±0.22 10 364 1.03±0.16 0.30±0.27 7.5 5 10 079 1.33±0.16 0.60±0.22 10 085 0.98±0.19 0.40±0.41 15.0 5 10 019 1.33±0.38 2.00±0.35 10 086 1.56±0.11 2.38±1.07 30.0(24 h采样) 5 9 879 1.37±0.30 2.12±1.07 10 131 1.34±0.12 2.07±1.08 30.0(48 h采样) 5 9 340 1.44±0.30 1.38±1.31 9 642 1.45±0.22 1.45±0.94 阳性对照组 5 10 192 0.78±0.10 17.62±10.40* 10 673 0.85±0.09 26.31±4.34* *P<0.05,与溶媒对照组比较。 -
细菌回复突变试验的结果判定是将各剂量组的受试物与溶媒对照组的回复突变菌落数进行比较,如果某个组别的回复突变菌落数是溶媒对照组突变菌落数的2倍及以上,且可重复性,并在剂量范围内存在着剂量-反应关系,则判断为阳性;体外染色体畸变试验和体内微核试验的结果,也是与溶媒对照组进行比较,均采用卡方检验,检验标准以P<0.05为有统计学差异。
Evaluation on genotoxicities of raceanisodamine hydrochloride injection
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206035
- Received Date: 2022-06-09
- Rev Recd Date: 2022-09-21
- Publish Date: 2023-01-25
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Key words:
- raceanisodamine hydrochloride /
- genetic toxicities /
- bacterial reverse mutation test /
- chromosomal aberration test /
- micronucleus test
Abstract:
Citation: | TIAN Yijun, SHI Wenjing, DONG Yachun, ZHANG Tianbao, ZHU Yuping. Evaluation on genotoxicities of raceanisodamine hydrochloride injection[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(1): 50-55. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202206035 |